王秀艷，田艷春

（赤峰學院 生命科學學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

乙烯利對香菇液體菌種菌絲體干重和胞外多糖得率的影響

王秀艷，田艷春

（赤峰學院 生命科學學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

在香菇液體培基中加入不同濃度乙烯利作為刺激因子，測量乙烯利對香菇菌絲體干重和胞外多糖含量的影響.實驗表明乙烯利濃度在小于10ppm時對菌絲體干重及胞外多糖得率均有促進作用，并測出濃度為8ppm時作用最強.乙烯利濃度大于10ppm時有抑制作用，其中，當乙烯利濃度為8ppm時菌絲體干重最重、菌絲體胞外多糖得率最高.

香菇；乙烯利；菌絲體干重；胞外多糖

香菇（Flammulina velutipes）又稱花蕈、香信、椎茸、冬菰、厚菇、花菇.在分類學上隸屬真菌門，擔子菌綱，傘菌目，口蘑科，香菇屬，學名Lentinus edodes（Berk.）sing.

香菇子實體含大量的蛋白質(zhì)，其中氨基酸多達18種，人體必需的氨基酸在香菇中就有7種，脂肪中含有大量的亞麻油酸，灰分中含有大量的鈣、鐵、錳等都是造血物質(zhì)，營養(yǎng)價值很高.此外，香菇還有很好的藥用價值，它能預(yù)防感冒和肝硬化，并有降低血壓、減少膽固醇和增強人體對癌癥的免疫力.香菇是人們重要的食用、藥用菌和調(diào)味品.

乙烯利是一種用途很廣的生長調(diào)節(jié)劑，容易被真菌吸收，乙烯利進入細胞后，逐漸分解釋放出乙烯，能起到內(nèi)源激素乙烯的生理作用，促進菌絲生長，本實驗研究了不同濃度乙烯利對香菇液體菌種菌絲體干重、胞外多糖得率的影響，以期為生產(chǎn)合理添加有關(guān)營養(yǎng)成分，保證高產(chǎn)穩(wěn)定提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌種：江蘇省江都市天達食用菌研究所提供

1.1.2 實驗藥品：乙烯利

1.1.3 儀器：超凈工作臺、滅菌鍋、水浴鍋、慍溫培養(yǎng)箱、723分光光度計、烘干箱

1.1.4 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL

液體培養(yǎng)基：玉米粉3％、硫酸鎂0.3％、磷酸二氫鉀0.15％、維生素B1微量、蔗糖1％、玻璃珠10粒.

1.2 刺激因子（乙烯利）濃度設(shè)置為2ppm、4ppm、8ppm、10ppm、15ppm，以0ppm為參照，每組設(shè)4個重復(fù).

1.3 實驗方法

1.3.1 PDA培養(yǎng)基的制備滅菌及檢測

選擇質(zhì)量較好的馬鈴薯（無病、未出芽、不干縮）洗凈去皮，挖去芽眼，切成厚度均勻的薄片稱取200g,加水1000mL,煮沸10—15min，至酥而不爛的程度，用6層紗布過濾一次，取其濾液，加入瓊脂20g,用小火加熱至瓊脂全部溶解（加瓊脂的過程中需邊加邊用玻璃棒攪拌），煮沸后加入葡萄糖20g，使藥品全部溶解.制備好的培養(yǎng)基趁熱分裝到20mm×200mm的干燥試管中.一般裝入量為試管總長度的1/5.分裝時應(yīng)盡量注意勿使培養(yǎng)基黏附在試管口壁上，如有黏附則應(yīng)用干凈紗布擦去，分裝好的試管塞上棉塞，棉塞在試管內(nèi)外的比例為2:1.

塞好棉塞的試管每10支捆成一捆，上面用二層報紙包扎好，以免滅菌時水蒸氣浸濕棉塞.然后豎直放入高壓鍋內(nèi)滅菌30min，滅菌壓力1.47×105Pa，溫度為 121℃.

滅菌后，待滅菌鍋內(nèi)的溫度降到60℃時取出試管擺成斜面，以防止冷凝水積聚過多，斜面的長度以占試管總長度的3/4為宜.

滅菌后的斜面培養(yǎng)基，在使用前應(yīng)進行無菌檢測，即從制備的斜面培養(yǎng)基中隨機抽取3-5支，置于30±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，如果3d后培養(yǎng)基表面光滑，無雜菌出現(xiàn)方可使用.

1.3.2 母種的擴繁及培養(yǎng)

轉(zhuǎn)管擴大培養(yǎng)工作在紫外燈殺菌環(huán)境的無菌超凈工作臺中進行.接種前，將斜面培養(yǎng)基，接種工具，香菇母種，灑精燈，75％灑精棉等放入超凈工作臺，封閉進行紫外燈照射消毒30min，然后關(guān)閉紫外燈，打開吹風，進行擴繁.

首先將洗干凈的雙手伸入超凈工作臺中，用灑精棉擦拭雙手和菌種試管外壁，點燃灑精燈，灼燒接種鏟.然后，左手拿斜面試管和菌種管，用右手小拇指和無名指夾住試管的棉塞拔出，將灼燒的接種鏟在火焰上方慢慢伸入母種試管中，待溫度不能灼傷菌種時，鏟出蠶豆大小的菌塊，慢慢將菌種鏟抽出，注意不要使菌種塊及菌種鏟碰到試管內(nèi)壁，取出后不可使菌塊通過火焰，迅速將接種鏟在火焰旁伸進另一試管，將菌塊放在培養(yǎng)基中部，菌絲朝上，慢慢抽出接種鏟后，勿碰試管內(nèi)壁，然后塞好棉塞，重復(fù)上述操作.將接好的試管放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24±1℃黑暗條件下培養(yǎng)7d左右，在此期間應(yīng)每天觀察一次，如有雜菌感染應(yīng)及時將試管取出，以免污染其它菌種，待菌絲長滿斜面，挑選菌絲生長健壯、潔白、濃密、均勻進行使用或保藏.

1.3.3 液體培養(yǎng)基的制備

首先按配方在70℃恒溫水浴鍋里乳化玉米粉，過濾后取其上清液粉狀到250ml錐形瓶內(nèi)，每瓶100ml，然后每瓶加入硫酸鎂0.15g、磷酸二氫鉀0.3g、維生素B15mg、蔗糖1g、玻璃珠10粒、最后用8層紗布封口，用報紙包好后與接種鏟、鑷子、小托盤一起放入滅菌鍋內(nèi)滅菌30min.

1.3.4 液體菌種接種、靜置培養(yǎng)及搖床培養(yǎng)

首先將滅菌鍋內(nèi)的錐形瓶與接種鏟、鑷子、小托盤從滅菌鍋內(nèi)取出置于超凈工作臺內(nèi)，篩選出幾只長勢較好的斜面菌種放入超凈工作臺內(nèi)，紫外線滅菌30min.30min后關(guān)掉紫外燈，打開風機，洗凈雙手伸進超凈工作臺.用灑精棉球擦拭雙手，點燃灑精燈.灼燒接種鏟，邊灼燒邊伸入試管內(nèi)，待接種鏟冷卻后，鏟出面積為1.5cm2的菌塊（盡量保持所有的菌塊大小一致），用右手掀去錐形瓶紗布將菌塊接入液體培養(yǎng)基內(nèi)，保持菌絲朝上，封好棉塞，連續(xù)接種.將接好菌種的錐形瓶放入24±1℃恒溫箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)24h，然后置于搖床上振蕩培養(yǎng)7d（培養(yǎng)條件：溫度為24±1℃，轉(zhuǎn)速為160R/min），在培養(yǎng)期間要每天觀察1—2次，首先看是否有雜菌感染，其次是保持通風保證菌絲體有氧呼吸，最后觀察菌絲球的生長狀況，菌絲球分布均勻，菌液澄清，有菇香味為生長成熟，即制備好種子液，挑選優(yōu)質(zhì)的備用.

1.3.5 刺激因子（乙烯利）的添加

首先按1.3.3方法制備液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制備好后同優(yōu)質(zhì)種子液、乙烯利母液，移液槍等工具一同放入超凈工作臺，紫外燈滅菌30min.

然后向每個錐形瓶加入10ml種子液，用移液槍向錐形瓶中分別加入不同量的乙烯利母液.使其濃度分別為 2ppm、4ppm、8ppm、10ppm、15ppm，以0ppm為參照，每組設(shè)4個重復(fù).

最后將接好種子液及乙烯利的錐形瓶封好口放至24±1℃，160rpm的搖床中培養(yǎng).在培養(yǎng)期間每天觀察2次，（如有污染，應(yīng)及時處理）觀察各錐形瓶中菌種的長勢，培養(yǎng)3-4d待液體菌種菌絲球成熟，胞外液澄清，有淡淡的菇香味關(guān)閉搖床.

1.3.6 菌絲體干重的測定

用6層紗布過濾，將過濾的菌絲球放入烘干箱，60℃烘干至恒重，測其干重，并胞外液放入4℃冰箱中保存1-2d，以待進行胞外多糖測定.

1.3.7 胞外多糖的測定

1.3.7.1 標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法測胞外多糖，準確稱取烘干后的葡萄糖0.1g，用去離子水定容到100mL的容量瓶中，其葡萄糖濃度為1mg/mL.準確稱取苯酚9g，加54mL去離子水，得濃度為15％的苯酚溶液.取9支試管，1支為空白對照管，另外選取8個濃度的葡萄糖溶液來做平行實驗，分別加入葡萄糖0μL，160μL，180μL，200μL，220μL，240μL，260μL，280μL，300μL，再分別加蒸餾水 2.0mL，1.84mL，1.82mL，1.80mL，1.78mL，1.76mL，1.74mL，1.72mL，1.70mL，每管中再加入15％的苯酚1mL，振蕩，搖勻，再加入5mL濃硫酸，迅速振蕩搖勻.（具體的藥品添加量見表1）.置25℃水浴鍋中保溫20min，取出，于490nm光下測定其光吸收值（見表2所測結(jié)果）.以葡萄糖濃度作為橫坐標，以光吸收值作為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1）.

表1 繪制標準曲線所加藥品列表

表2 490nm處測定不同葡萄糖濃度吸光值結(jié)果

1.3.7.3 樣品多糖含量的測定

取樣品液稀釋500倍，即用移液槍吸取20μL樣品液，加入9.98mL去離子水，稀釋后的樣品體積為10mL，五個小組各取稀釋后的樣品液2mL，各加入1mL的15％的苯酚，5mL的濃硫酸，振蕩混勻后，在25℃的水浴箱中保溫20min，取出后，于490nm處測定吸光值.吸取一定量的試管中的液體于石英杯中，保證透光面干凈，外表面無液體，按順序放入暗槽中進行測量.每一樣品的OD值都按上述步驟操作，用標準曲線計算其多糖含量.每管兩次，取平均值以保證其準確性.

根據(jù)葡萄糖標準曲線得出所得同線的方程表達式y(tǒng)=0.0116x+0.056，又表3所得出的樣品光吸收值可以求出樣品中葡萄糖得率，如表4所示.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙烯利對菌絲體干重的影響

表3 樣品光吸收值的測定結(jié)果

表4 由標準曲線所得樣品中葡萄糖得率

由圖2分析可知，香菇菌絲體在乙烯利濃度為2—8ppm的范圍內(nèi)均能生長.當乙烯利濃度在2—10ppm之間時對菌絲體生長均有促進作用，在該濃度范圍內(nèi)隨著乙烯利濃度的增高菌絲體干重得率增加，二者呈正相關(guān)，且在濃度為8ppm時菌絲體干重得率最大，較其它處理相比，菌絲體干重得率達到了極顯著的水平，菌絲體長勢良好，菌絲球潔白，分枝均勻、濃密、粗壯.當乙烯利濃度在8—10ppm之間時，對菌絲體生長也有促進作用，但二者呈負相關(guān).當乙烯利濃度大于8ppm，隨著乙烯利濃度的增加菌絲體干重得率減小，即菌絲體生長受到抑制.

2.2 不同濃度乙烯利對香菇菌絲體胞外多糖得率的影響

由圖3分析可知，當乙烯利濃度在2—8ppm之間時胞外多糖含量隨著乙烯利濃度的增加不斷的升高，二者呈正相關(guān)，且在乙烯利濃度為8ppm時，胞外多糖含量達到峰值；當乙烯利濃度在8—10ppm之間時，對菌絲體生長也有促進作用，但二者呈負相關(guān).當乙烯利濃度大于10ppm時胞外多糖的含量隨乙烯利濃度的增加不斷下降.

由圖2、3共同分析可知，乙烯利濃度對菌絲體干重和胞外多糖得率的影響圖示趨勢基本一致.當乙烯利濃度在2—10ppm之間時對菌絲體干重得率和胞外多糖得率均有促進作用，即該乙烯利濃度范圍內(nèi)對菌絲體生長有促進作用，且二者均在乙烯利濃度為8ppm時達到峰值.乙烯利濃度大于10ppm之后時菌絲體干重得率和胞外多糖得率均隨乙烯利濃度增加而降低，即超出該乙烯利濃度范圍內(nèi)對菌絲體生長有抑制作用.

3 結(jié)論

3.1 在培養(yǎng)基中加入同體積不同濃度的乙烯利對香菇菌絲體生長均有不同程度的影響.

3.2 當乙烯利濃度為8ppm時，菌絲體干重得率和胞外多糖得率均達到峰值.

3.3 刺激因子乙烯利在2—8ppm范圍內(nèi)與香菇菌絲體干重得率和胞外多糖得率呈正相關(guān)，即隨乙烯利濃度的升高香菇菌絲體干重和胞外多糖含量增加.

3.4 刺激因子乙烯利在8—10ppm范圍內(nèi)與香菇菌絲體干重得率呈負相關(guān)，在大于10ppm之后對菌絲體生長有抑制作用.在8—10ppm范圍內(nèi)與香菇菌絲體胞外多糖得率呈負相關(guān)，大于10ppm之后對菌絲體生長有抑制作用.

由以上分析可知，當香菇液體培養(yǎng)基中加入體積濃度為8ppm的乙烯利時對菌絲體干重和胞外多糖含量影響最明顯，同時菌絲體干重得率和胞外多糖得率達到峰值.這些應(yīng)用到具體的生產(chǎn)實踐中可以提高香菇的產(chǎn)量，對香菇液體產(chǎn)品開發(fā)和利用具有重要意義.因此，在實際生產(chǎn)中可通過調(diào)節(jié)乙烯利濃度指導(dǎo)生產(chǎn)，促進穩(wěn)定高產(chǎn).

〔1〕王桂芹,王秀艷.食用菌栽培[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古科技技術(shù)出版社，2001.

〔2〕卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科學技術(shù)出版社，2000.

〔3〕黃清榮,姜華,董洪新,劉林德,賈莉.榆黃菇發(fā)酵菌絲體及胞外多糖的影響因子的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（22）:5792-5793.

〔4〕盧青達,馬啟明.食用菌[M].濟南:山東科技出版社，1986.

〔5〕貢濟宇.苯酚硫酸法測定靈芝多糖含量的研究[J].長春中醫(yī)學院學報,1997（2）：82—86.

〔6〕張桂春,辛小林,李紹龍.榆黃菇發(fā)酵全液多糖提取工藝優(yōu)化[J].食用菌,2005（4）：62—64.

〔7〕王謙,張俊剛,郝利民，等.黃傘深層液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2004（25）：498—499.

〔8〕Solomko EF.Eliseera GS,Biosynthesis of Bvitam ins by the hroom Pluertus sdtreatrs in the submerged culture:peikl Bim ikroviol.1998,24（2）：164-169.

S646.1

A

1673-260X（2011）11-0144-04