李志斐,謝 駿,龔?fù)麑?余德光,王廣軍,唐小江(.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 廣東5080；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 2006；.廣東省職業(yè)病防治院,廣州 廣東 5000)

三甲基氯化錫對水生生物的毒性效應(yīng)

李志斐1,2,謝 駿1*,龔?fù)麑?,余德光1,王廣軍1,唐小江3(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 廣東510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306；3.廣東省職業(yè)病防治院,廣州 廣東 510300)

研究了三甲基氯化錫(TMT)對蛋白核小球藻、大型溞和斑馬魚的急性毒性影響.結(jié)果表明,TMT在實驗濃度下,對蛋白核小球藻的生長有抑制作用,濃度越高抑制作用越明顯.較高濃度組(5.31,20mg/L)可致死部分蛋白核小球藻細(xì)胞,TMT對蛋白核小球藻的 96h-EC50為0.46mg/L,屬于極高毒物質(zhì);TMT對大型溞的 48h-LC50為 0.087mg/L,也屬于極高毒性;TMT對斑馬魚的 96h-LC50為 2.45mg/L,屬于高毒性.TMT對這3種水生生物的抑制率/致死率(EC50/LC50)隨時間呈規(guī)律性變化.TMT的神經(jīng)毒性和親脂特性可能是其對水生生物較高毒性的主要原因.

TMT；毒性；蛋白核小球藻；大型溞；斑馬魚

三甲基氯化錫(TMT)是一種重要的有機錫化合物,廣泛用于工業(yè)塑料熱穩(wěn)定劑中.隨著塑料工業(yè)及二手塑料再加工的迅速發(fā)展,TMT會隨生產(chǎn)廢水、地表徑流等途徑進(jìn)入水環(huán)境中,TMT也曾用于化學(xué)消毒劑和殺菌滅蟲劑,且 TMT在塑料中的濃度高達(dá)8.5～24.9mg/kg[1].TMT具有很好的親水性和親脂性[2-3],極易通過消化和皮膚黏膜進(jìn)入機體,對水生生物產(chǎn)生毒性并在體內(nèi)富集[4-6].在海洋、江河、水庫、地下水、水生生物機體內(nèi)等均發(fā)現(xiàn) TMT的存在[7-9],因此極有可能對水生生物造成潛在危害.

目前國內(nèi)外關(guān)于TMT對水生生物的毒性效應(yīng)研究多集中在TMT的神經(jīng)效應(yīng)及生物累積性等方面,如Wang等[10]就TMT對褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus)腦神經(jīng)效應(yīng)進(jìn)行了報道,Hadjispyrou等[5]就鹵蟲對TMT的富集進(jìn)行了報道.而對其進(jìn)入水環(huán)境后對整個水生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險性評價并不多,因此本研究以水生生物中 3大營養(yǎng)級上的代表生物(蛋白核小球藻(Chlorelapyrenoidosa)、大型溞(Daphnia magna)和斑馬魚(Danio rerio))為實驗材料,研究了TMT對三種不同水生生物的急性毒性,旨在判斷其對水生生物可能造成的危害,為有關(guān)水生態(tài)風(fēng)險評價提供參考依據(jù),并為相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白核小球藻購于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫, BG11培養(yǎng);大型溞取自河北大學(xué)生物修復(fù)技術(shù)研究實驗室,參照大型溞測試標(biāo)準(zhǔn)方法[11]進(jìn)行飼養(yǎng),經(jīng)實驗室馴化培養(yǎng)后使其保持在孤雌生殖狀態(tài);斑馬魚(AB系)來自廣州市花地灣市場,為當(dāng)年生、同一批次斑馬魚,平均體長(2.4±0.2)cm,馴養(yǎng)2周以上,自然死亡率＜1%.

三甲基氯化錫購自美國Acres organics公司,常溫下為白色結(jié)晶狀物質(zhì),純度＞99%.

1.2 藻類生長抑制試驗

參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行.根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,確定TMT的濃度范圍為 0.1～20mg/L,按等對數(shù)間距設(shè)置5個試驗濃度和1個對照組,每次試驗設(shè)3個平行樣.在500mL三角瓶中加入20mL藻(處于對數(shù)同步生長期)試驗液,分別添加30mL不同濃度TMT溶液,溶液終體積 200mL,混合溶液蛋白核小球藻的初始接種密度為5×105個/mL.培養(yǎng)條件: pH7.6,溫度(24±1),℃光強為4000lx,光暗比為l4h∶10h,每天定期搖動藻液 3 次,每次 10min.所用玻璃器皿和培養(yǎng)液均經(jīng)過 121℃、25min滅菌.實驗進(jìn)行到0,24,48,72,96h定時取樣用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞密度,每次取樣相對偏差＜10%.

[13]以對照組的平均值作對照,求各個濃度組的抑制率,采用機率單位法計算各時間的 EC50及相關(guān)方程.EC50值計算步驟為,先通過查表,將蛋白核小球藻的抑制速率換算成概率單位,然后將 TMT濃度對數(shù)與概率單位進(jìn)行一元線性回歸,得到TMT對小球藻的劑量-反應(yīng)方程,當(dāng)概率單位為 5時,通過回歸方程計算EC50值.

1.3 大型溞活動抑制試驗

參照大型溞測試標(biāo)準(zhǔn)方法[11]進(jìn)行.大型溞為本實驗連續(xù)培養(yǎng) 3代以上的單克隆品系.根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果,確定 TMT的濃度范圍為 0.05～0.50mg/L,按等對數(shù)間距設(shè)置11個TMT的試驗濃度和一個對照組,每次試驗設(shè)4個平行樣,結(jié)果取4組平均值.在100mL燒杯內(nèi)加入50mL設(shè)定濃度的 TMT溶液和 10只(溞齡＜24h)幼溞,用保鮮膜封口以減少蒸發(fā).試驗水溫為(23±1),℃pH7.6,24h光照黑暗循環(huán),光照強度 2000lx,靜置培養(yǎng).分別在24,48h觀察記錄大型溞的中毒及死亡狀況.轉(zhuǎn)動試驗燒杯,15s內(nèi)活動距離不超過本身的長度,即認(rèn)為大型溞活動受到抑制,即使觸角仍在擺動的大型溞,也認(rèn)為是受抑制的個體.大型溞的死亡以其心臟停止跳動為標(biāo)志[13].采用機率單位法計算各時間的半數(shù)致死濃度(LC50)和半效應(yīng)濃度(EC50)及相關(guān)方程[13].

1.4 斑馬魚急性毒性試驗

參照標(biāo)準(zhǔn)方法[14]進(jìn)行.在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上得出的濃度范圍 1.6～10mg/L.設(shè)置 17個濃度梯度,同時以空白為對照,均設(shè)4個平行.結(jié)果取4組平均值.在每一試驗濃度組和對照試驗組容器隨機放入10尾斑馬魚.每24h更換試驗液1/2,試驗水溫為(23±1)℃,pH7.6,自然光照,靜置培養(yǎng),試驗期間不投放餌料.于 24,48,72,96h觀察記錄斑馬魚的中毒及死亡情況,以沒有肉眼可見的活動、鰓的翕動停止及觸碰尾部無反應(yīng)為斑馬魚死亡標(biāo)準(zhǔn),采用機率單位法[13]計算各時間的LC50及相關(guān)方程.

2 結(jié)果與分析

2.1 TMT對蛋白核小球藻的生長抑制效應(yīng)

從蛋白核小球藻 96h生長試驗結(jié)果可看出(圖1),蛋白核小球藻在TMT中生長受到一定的抑制,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.在整個生長試驗過程中,0.1,0.38和1.41mg/L處理下蛋白核小球藻生長受到抑制,生長緩慢,5.31mg/L處理為零增長;20mg/L處理則表現(xiàn)為很強的抑制作用,蛋白核小球藻長勢從試驗開始就下降直至實驗液逐漸透明.顯微鏡觀察到藻體開始分解,大量藻細(xì)胞死亡.直到實驗結(jié)束 96h時,0.1,0.38,1.41,5.31和20mg/L濃度組與96h對照組相比抑制率分別為34%,48%,58%,77%和92%.

圖1 TMT對蛋白核小球藻的毒性曲線Fig.1 Toxicity curve of TMT for Chlorela pyrenoidosa

通過機率單位法計算出的不同時間的劑量效應(yīng)方程(表 1)可知,TMT對蛋白核小球藻急性毒性試驗的各方程相關(guān)系數(shù)為0.9671～0.9937,具有較好的線性相關(guān)性,表明試驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠.根據(jù)各相關(guān)方程求出 TMT對蛋白核小球藻24,48,72及96h的EC50值分別為0.46,1.27,5.36和 20.9mg/L.按照水生生物毒性分級[15],TMT屬于極高毒性.

表1 TMT對蛋白核小球藻的急性毒性影響Table 1 The acute toxicity of TMT on Chlorela pyrenoidosa

2.2 TMT對大型溞的急性毒性影響

從大型溞48h急性毒性試驗結(jié)果可看出(圖2),TMT對大型溞的活動產(chǎn)生了明顯的抑制,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.隨著試驗時間的延長和 TMT濃度增加,大型溞的死亡率和抑制率逐漸增加.當(dāng) TMT濃度為 0.05mg/L時,48h對大型溞活動產(chǎn)生部分抑制,但無死亡現(xiàn)象;當(dāng)TMT濃度為0.185mg/L時,24h大型溞的死亡率為60%,抑制率為80%,48h大型溞的死亡率已升到100%.

根據(jù)相關(guān)方程求得 TMT對大型溞的 24h,48h的 LC50分別為 0.150,0.087mg/L;24h,48h的EC50分別為 0.113,0.063mg/L.參照有關(guān)毒性分級[13],TMT對大型溞的毒性屬極高毒性.

圖2 TMT對大型溞的毒性曲線Fig.2 Toxicity curve of TMT for Daphnia magna

表2 TMT對大型溞的急性毒性影響Table 2 The acute toxicity of TMT on Daphnia magna

2.3 TMT對斑馬魚的急性毒性影響

圖3 TMT 對斑馬魚的毒性曲線Fig.3 Toxicity curve of TMT for Danio rerio

從斑馬魚96h急性毒性試驗結(jié)果可看出(圖3),TMT對斑馬魚的存活產(chǎn)生了明顯抑制,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.隨著試驗時間的延長和 TMT濃度增加,斑馬魚的死亡率逐漸增加.24h的死亡劑量數(shù)據(jù)與48h,72h,96h的相差較大,當(dāng)TMT濃度處于2～4.5mg/L之間,24h內(nèi)對斑馬魚的死亡率沒有明顯的影響,而48h,72h和96h的死亡率處于急劇上升的趨勢,可以看出 TMT對斑馬魚毒性與時間具有較高的相關(guān)性.

根據(jù)相關(guān)方程求得 TMT對斑馬魚的 24h,48h,72h及 96h的 LC50分別為 7.36,4.13,3.06,2.45mg/L;參照有關(guān)毒性分級[13],TMT對斑馬魚的毒性屬高毒性.

表3 TMT對斑馬魚的急性毒性影響Table 3 The acute toxicity of TMT on Danio rerio

3 討論

3.1 TMT對3種水生生物毒性效應(yīng)的比較

TMT對蛋白核小球藻的 96h-EC50為0.46mg/L;對大型溞的 24h-LC50、48h-LC50分別為 0.150和 0.087mg/L;對斑馬魚 96h-LC50為2.45mg/L.根據(jù)有關(guān)毒性分級[13],TMT對3種水生生物的毒性較高,小球藻和大型溞屬于極高毒,斑馬魚屬高毒.Nagase等[16]報道的 TMT對青鳉的LC50為 5.62mg/L;Hadjispyrou等[5]和 Vighi等[17]報道的TMT對鹵蟲和大型溞的24h-LC50分別為0.22mg/L和0.48mg/L;以上研究結(jié)果與本實驗結(jié)果吻合.而Wong等[18]報道的TMT對鐮形纖維藻的EC50為5.5mg/L,與小球藻相差較大,這可能是藻種類不同的原因.

就敏感性而言,一般認(rèn)為,有機錫化合物對藻類敏感性強于水蚤,王珊珊等[19]利用斜生柵藻和大型溞測定 4種丁基錫的毒性時卻發(fā)現(xiàn)藻的敏感性明顯高于水蚤.根據(jù)文獻(xiàn)[20-22]發(fā)現(xiàn)三苯基錫對藻(扁藻、金藻、新月菱形藻和三角褐指藻)的96h-EC50為 1～7μg/L,對大型溞的 24h-EC50為13.33μg/L,即藻敏感性略高于水蚤.本實驗中,以小球藻 96h-EC50、大型溞 48h-LC50和斑馬魚96h-LC50作為 TMT毒性測試指標(biāo),可以看出水中不同營養(yǎng)級的生物對TMT的敏感性存在差異大型溞的敏感性最強,蛋白核小球藻和斑馬魚次之.其規(guī)律同大多數(shù)水生生物毒性測試相似[23],而與大多數(shù)有機錫化合物對藻和水蚤的敏感性不同.可見,藻類和水蚤對不同有機錫的敏感性有顯著差異,這與生物本身的生理特點有關(guān),也與不同有機錫的選擇特異性有關(guān).大型溞的毒性效應(yīng)最強,可能與大型溞表面的疏水性以及 TMT的親脂性和較高的神經(jīng)毒性[24]有關(guān).

對不同生物的毒性差異表明,建立在食物鏈層次上的綜合水生生態(tài)毒性試驗結(jié)果,有助于更加全面系統(tǒng)地了解有機錫進(jìn)入水環(huán)境后的生態(tài)后果[25].

3.2 TMT的水生態(tài)風(fēng)險性評價

根據(jù)歐盟化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險評價技術(shù)指南(TGD)[26]的商值法對自然水體中的TMT進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評價.評價方法為:首先用3個營養(yǎng)級水平(藻、溞、魚)急性毒性試驗 EC50/LC50值與評價系數(shù)(1000)之比預(yù)測出無影響濃度(PNEC),再用化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境濃度(PEC)與PNEC的比值得到風(fēng)險表征,進(jìn)而評判化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境安全性.其中風(fēng)險表征(PEC/PNEC)＞1時,意味著化學(xué)物質(zhì)對其周邊水體的生物構(gòu)成了風(fēng)險.根據(jù)歐盟評價方法和本實驗數(shù)據(jù)預(yù)測出TMT對3個營養(yǎng)級的無影響濃度如下:藻(PNEC)為 0.46μg/L;溞(PNEC)為 0.087μg/L;魚(PNEC)為 2.45μg/L.以最低值0.087μg/L作為 TMT對水生生物的無影響濃度.Shawky等[7]對德國北海和易北河水體研究顯示TMT含量在2～11ng/L.Liu等[8]對北京官廳水庫和永定河水體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn) TMT含量高達(dá)0.36μg/L.邱士起等[9]對珠海市某工業(yè)區(qū)地下水進(jìn)行調(diào)查,能檢出 TMT含量竟高達(dá) 0.107mg/L.可以看出,已超過實驗研究的無影響濃度,檢出的TMT其水生態(tài)風(fēng)險不可忽視.據(jù)文獻(xiàn)報道[5],TMT具有顯著的生物積累性,鹵蟲體內(nèi)的含量為水中含量的75倍,TMT還可以和其他污染物(重金屬等)結(jié)合具有協(xié)同作用增加毒性作用.因此,即使水中 TMT含量不高,不會產(chǎn)生急性毒性,但也存在著通過生物蓄積和食物鏈傳遞而危及人類的潛在風(fēng)險.隨著有機錫熱穩(wěn)定劑的大量使用,TMT在中國水體環(huán)境中的污染面將不斷擴大并對水生生物乃至人類健康產(chǎn)生潛在的威脅.

4 結(jié)論

4.1 TMT對于3種不同營養(yǎng)級的水生生物均有很強的毒性,TMT對蛋白核小球藻的 96h-EC50為 0.46mg/L,屬于極高毒物質(zhì);TMT對大型溞的48h-LC50為0.087mg/L,屬于極高毒物質(zhì);TMT對斑馬魚96h-LC50為2.45mg/L,屬于高毒物質(zhì).且3種水生生物死亡及抑制效應(yīng)均與TMT的濃度顯著相關(guān),呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

4.2 不同物種對本次研究的兩種藥物敏感程度不同.本次研究中,大型溞對于TMT最敏感,蛋白核小球藻次之,斑馬魚最弱.

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Toxicity effect of Trimethyltin chloride on aquatic organisms.

LI Zhi-fei1,2, XIE Jun1*, GONG Wang-bao1, YU De-guang1, WANG Guang-jun1, TANG Xiao-jiang3(1.Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China；2.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；3.Guangdong Prevention and Treatment Center Occupational Diseases, Guangzhou 510300,China). China Environmental Science, 2011,31(4)：642～646

A study was carried out on the acute toxicity effects of Trimethyltin chloride (TMT) on Chlorela pyrenoidosa,Daphnia magna and Danio rerio. The results suggested that the growth of Chlorela pyrenoidosa was inhibited in the TMT of experimental content, the inhibiting effect increased significantly with the concentration increasing. The part of Chlorela pyrenoidosa cells even would be lethal in the higher concentration group(5.31,20mg/L).The toxic effects of TMT had the highest toxicity to Chlorela pyrenoidosa and Daphnia magna, and the 96h-EC50and 48h-LC50was 0.46mg/L and 0.087mg/L, respectively. while was high-toxic to Danio rerio, the 96h-LC50concentration was 2.45mg/L. EC50/LC50changed regularly with the test time. The two main reasons leading to the potential threat to the aquatic organisms could be the neurotoxicity and lipophilic property of TMT.

TMT；toxicity；Chlorela pyrenoidosa；Daphnia magna；Danio rerio

X503.2

A

1000-6923(2011)04-0642-05

2010-08-17

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(nycytx-49-13)廣東省海洋漁業(yè)科技推廣項目(A200901D04);國家自然科學(xué)基金項目(30771786)

* 責(zé)任作者, 研究員, xiejunhy@yahoo.com.cn

李志斐(1983-),男,河南安陽人,上海海洋大學(xué)碩士研究生,主要從事生態(tài)環(huán)境毒理學(xué)研究.