成卓韋,顧信娜,蔣軼鋒*陳建孟,陳 浚(.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 30032；2.浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境工程研究中心,浙江 杭州 30032)

1株α-蒎烯降解菌的分離鑒定及降解特性研究

成卓韋1,顧信娜1,蔣軼鋒1*陳建孟2**,陳 浚1(1.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310032；2.浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境工程研究中心,浙江 杭州 310032)

從處理廢氣的生物濾塔內(nèi)篩選到1株能高效降解α-蒎烯的菌株P(guān)T.通過(guò)菌落形態(tài)、生理生化特征、16SrRNA基因序列相似性分析及Biolog鑒定等方法,確定該菌株屬于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens).菌株P(guān)T最佳生長(zhǎng)條件為: NaCl濃度0.00%、pH7.13、溫度25.5℃,降解速率達(dá)到最大值5.22mg/(L?h).降解過(guò)程符合Haldane’s抑制生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型,最大比降解速率為0.0364h-1.菌株P(guān)T能不同程度地降解一些分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單或與α-蒎烯結(jié)構(gòu)相似的工業(yè)有機(jī)污染物.代謝產(chǎn)物分析表明,菌株P(guān)T在降解α-蒎烯的過(guò)程中產(chǎn)生檸檬油精紫蘇酸等結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的物質(zhì),它們最終被完全礦化為CO2或合成細(xì)胞自身組成物質(zhì).碳平衡分析表明,底物有機(jī)碳含量完全礦化和轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物量的比例分別為64.83%和30.37%.

α-蒎烯；生物降解；動(dòng)力學(xué)；礦化率；代謝途徑

萜類(lèi)化合物作為重要的化工中間體,廣泛用于木材加工、香料制造、制藥等行業(yè).具有環(huán)烯烴結(jié)構(gòu)的α-蒎烯(C10H16)是單萜類(lèi)物質(zhì)的典型代表.α-蒎烯進(jìn)入大氣后,直接危害人類(lèi)健康,并與大氣中的臭氧、羥基等自由基發(fā)生反應(yīng),形成光化學(xué)煙霧,破壞臭氧層[1-3].目前,已報(bào)道的降解 α-蒎烯的微生物主要有假單胞菌(Pseudomonas)[4],白色芽孢桿菌(Bacillus pallidus)[5],曲霉菌(Aspergillus)[6],諾卡氏菌(Nocardia)[7]等.

研究降解菌株特性,對(duì)于利用微生物降解工業(yè)有機(jī)污染物具有理論意義,同時(shí),對(duì)于快速實(shí)現(xiàn)生物濾塔的掛膜啟動(dòng)也具有指導(dǎo)作用.課題組在前期處理α-蒎烯的生物濾塔[8]中,成功選育到1株能高效降解 α-蒎烯的菌株,鑒定為 Pseudomonas fluorescens.本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法,優(yōu)化菌株生長(zhǎng)條件,對(duì)其降解特性和動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行分析,并初步探討可能的降解途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物膜 從穩(wěn)定運(yùn)行的生物濾塔內(nèi)取1.5g生物填料于30mL無(wú)菌水中,振蕩離心后,將生物樣品懸浮于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7.2)中,備用.

1.1.2 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MM)(g/L):K2HPO4·3H2O 0.6g,KH2PO40.15g,NaNO32.25g,NH4Cl 2.86g,MgCl20.06g,CaCl20.006,FeSO4·7H2O 0.003g;微量母液 5mL(ZnCl288mg/L,MnCl260mg/L,KI 10mg/L,Na2MoO4100mg/L,H3BO450mg/L),pH值為7.0～7.2;110℃滅菌40min.添加一定濃度的α-蒎烯作為唯一碳源.

無(wú)機(jī)鹽篩選固體培養(yǎng)基:MM 培養(yǎng)基添加1.8%～2%的固體瓊脂,121℃滅菌 20min.滴加一定量的α-蒎烯于棉團(tuán)上用以釋放氣態(tài)碳源.

LB斜面保存培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10g,酵母粉5g,NaCl 5g,蒸餾水1L,瓊脂18g,pH值為7.0～7.2;121℃滅菌20min.

1.2 菌株分離純化

取0.5mL生物膜樣品,用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋,涂布于無(wú)機(jī)鹽篩選固體培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度做3個(gè)平行樣,30℃培養(yǎng).4～5d后,挑取平板上的單菌落,接入 MM 液體培養(yǎng)基中,以 α-蒎烯為唯一碳源,置于160r/min 搖床振蕩培養(yǎng),將具有 α-蒎烯降解能力的菌株進(jìn)行分離純化,最后 4℃斜面保藏.

1.3 菌株鑒定

菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)方法參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9].Biolog實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[10],采用GN2碳源板鑒定.

采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(V2.2,上海申能博彩生物科技有限公司),提取菌株的 DNA.選用細(xì)菌通用引物 BSF8/20和BSR1541/20(寶生物工程(大連)有限公司),序列分別為5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'和5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'.PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序,然后將測(cè)序結(jié)果同GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比較分析,選取 1.5kb左右長(zhǎng)度進(jìn)行比對(duì),采用鄰位連接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,大致確定菌株種屬情況.

1.4 環(huán)境因素對(duì)菌株降解效率的影響

運(yùn)用響應(yīng)面法考察了溫度、pH值和培養(yǎng)基鹽度 3個(gè)環(huán)境因素對(duì)菌株降解效率的影響, 參數(shù)設(shè)計(jì)見(jiàn)表 1.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株離心洗滌,徹底去除殘留的α-蒎烯后,懸浮于0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于 200mg/L α-蒎烯的 MM 培養(yǎng)液中加入上述菌懸液(生物量達(dá)到9.96mg/L),同時(shí)以不加菌懸液作為空白對(duì)照,密封后置于相應(yīng)條件下培養(yǎng),定時(shí)測(cè)定液相中殘留的 α-蒎烯和生物量.根據(jù)測(cè)得的降解速率,利用SAS system軟件(SAS,7.0 Version)對(duì)其進(jìn)行二次多元回歸,令回歸方程一階偏導(dǎo)數(shù)為零,得到響應(yīng)值最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的各因素組合,即為菌株最佳降解條件.

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experimental design

1.5 多種碳源降解能力測(cè)定

從固體培養(yǎng)基斜面上挑取1～2環(huán)到含α-蒎烯200mg/L的MM液體培養(yǎng)液中,30℃、160r/min搖床培養(yǎng).菌株活化后轉(zhuǎn)接到新鮮MM培養(yǎng)基中,繼續(xù)以α-蒎烯為唯一碳源培養(yǎng),待菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,9000r/min離心10min,用無(wú)菌水重復(fù)洗滌 3次,徹底去除殘留的 α-蒎烯后,懸浮于0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于 50mL MM 培養(yǎng)液中加入上述菌懸液(生物量達(dá)到9.96mg/L),分別以苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、石油醚、環(huán)己烷、正己烯環(huán)己烯、十四烷、甲基乙基酮等工業(yè)中常見(jiàn)的污染物作為碳源,濃度均控制為 200mg/L,密封后振蕩培養(yǎng)(160r/min,30).℃同時(shí)以不加菌液、含有200mg/L上述碳源的MM培養(yǎng)基為空白對(duì)照,定時(shí)測(cè)定降解率和生物量.

1.6 菌株降解動(dòng)力學(xué)研究

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液,于9000r/min、離心10min,用無(wú)菌水重復(fù)洗滌3次,徹底去除殘留的 α-蒎烯后懸浮于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于50mL MM培養(yǎng)液中加入上述菌懸液(生物量達(dá)到 10.28mg/L)后,分別加入 α-蒎烯,使其濃度達(dá)到 50,100,200,400,800,1000,1500和2000mg/L,密封后振蕩培養(yǎng)(160r/min,30).℃同時(shí)以不加菌液的MM培養(yǎng)基為空白對(duì)照,定時(shí)測(cè)定降解率和生物量.

1.7 礦化率測(cè)定與代謝途徑初探

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液9000r/min離心10min,用無(wú)菌水重復(fù)洗滌 3次,徹底去除殘留的α-蒎烯后懸浮于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中加入上述菌懸液(生物量達(dá)到10.54mg/L)后,分別加入 α-蒎烯,使其濃度達(dá)到 50和 200mg/L,密封后振蕩培養(yǎng)(160r/min,30).℃同時(shí)以不加菌液的磷酸緩沖溶液為空白對(duì)照,定時(shí)測(cè)定密封瓶上方氣相中的CO2和α-蒎烯濃度,液相中α-蒎烯濃度和相應(yīng)的TOC以及生物量.

1.8 分析方法

1.8.1 α-蒎烯分析 采用氣相色譜(Agilent 6890)對(duì)搖瓶上方 α-蒎烯氣體進(jìn)行定量分析.色譜柱為HP-Innowax 型毛細(xì)管柱(30m×0.32mm× 0.5μm),進(jìn)樣口和檢測(cè)器(FID)的溫度分別為 250℃和300,℃柱溫為140,℃柱流速1mL/min,進(jìn)樣體積800μL.液相中 α-蒎烯經(jīng)正己烷萃取后亦采用氣相色譜進(jìn)行定量分析.采用程序升溫: 40℃維持1min,20/min℃升溫至120,℃ 60/min℃升溫至180℃維持2min.柱流速1mL/min,進(jìn)樣體積1.0μL.

1.8.2 其他有機(jī)物分析 BTEX、環(huán)己烷、正己烯、環(huán)己烯、十四烷等萃取后同樣采用氣相色譜定量測(cè)定:色譜柱為 HP-Innowax型毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.5μm).進(jìn)樣口和檢測(cè)器(FID)的溫度分別為210℃和200,℃柱溫為90,℃柱流速1mL/min,進(jìn)樣量 1.0μL.甲基乙基酮采用氣相色譜直接測(cè)定:色譜柱為 HP-Innowax型毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.5μm).進(jìn)樣口和檢測(cè)器(FID)溫度分別為200℃和260,℃柱溫為90,℃柱流速1mL/min,進(jìn)樣量 1.0μL.

1.8.3 生物量測(cè)定 使用 722型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得出菌株濃度(以mg/L記).

1.8.4 代謝產(chǎn)物分析 CO2濃度分析采用鹽酸驅(qū)趕法使液相中的 CO2溢出進(jìn)入密封瓶上方的氣相中,用裝有熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)的氣相色譜(Agilent 6890)進(jìn)行定量分析,色譜柱為HP-Plot-Q 型毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×20μm),分析條件為柱溫40,℃進(jìn)樣口溫度90,℃檢測(cè)器溫度100.℃TOC分析:TOC測(cè)定采用總有機(jī)碳測(cè)定儀(TOCVCPH, Shimadzu).代謝有機(jī)產(chǎn)物分析:代謝產(chǎn)物經(jīng)衍生化后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Agilent 7890N/MS 5975)進(jìn)行分析.色譜柱為HP-5MS型毛細(xì)管柱,程序升溫:100℃保留1min,5/min ℃升高到 280℃并保留 10min,載氣為氦氣,柱流速1mL/min.質(zhì)譜條件:EI 源,電離能量70eV,離子源250,℃輔助溫度280,℃倍增電壓1000V,掃描質(zhì)量數(shù) 50～650amu.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 基本生理生化試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)初篩與復(fù)篩,選育到1株能高效降解α-蒎烯的菌株,編號(hào)為PT.該降解菌在MM瓊脂平板上30℃培養(yǎng)72h后,形成表面光滑透明的菌落.菌株 PT為革蘭氏陰性,成對(duì)聚集出現(xiàn),無(wú)鞭毛,無(wú)莢膜,無(wú)芽孢.相應(yīng)的生理生化試驗(yàn)結(jié)果為:過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)等均為陽(yáng)性;淀粉水解試驗(yàn)為陰性;菌株能利用葡萄糖但不能利用乳糖.

2.1.2 菌株P(guān)T的16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育 菌株P(guān)T的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序后(GenBank登錄號(hào)為 FJ169494),同GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),再通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立從而確定其在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位.比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)該菌株屬于 Pseudomonas屬,且同 Pseudomonas fluorescens相似性高達(dá)99%.菌株 PT與 Pseudomonas sp.中其他相近的模式株比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖 1(其中 Nocardia sp.和Geobacillus pallidus DSM 為文獻(xiàn)報(bào)道能降解α-蒎烯的菌株).結(jié)合菌株生理生化實(shí)驗(yàn)與 16S rRNA基因序列系統(tǒng)學(xué)的分析結(jié)果,菌株P(guān)T可鑒定為P. fluorescens.菌株P(guān)T于2008年10月27日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,編號(hào)為CCTCC M 208182.

圖1 菌株P(guān)T與Pseudomonas sp.中典型菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the strain PT with type strains of Pseudomonas sp.

2.1.3 菌株 Biolog 鑒定 采用 GN2平板分析菌株對(duì) 95種碳源的代謝能力,將結(jié)果與 Biolog系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)MicroLog software (Release Version 4.20.04)進(jìn)行比對(duì),進(jìn)一步確定其種屬特征,從而提高菌株鑒定的可靠性.培養(yǎng)6h后,菌株P(guān)T與P.fluorescens(熒光假單胞菌)相似度高達(dá) 0.805(臨界值為0.75)[11],為良好匹配.因此,結(jié)合16S rRNA基因序列分析,可以確定菌株 PT屬于 P.fluorescens.

2.2 環(huán)境因素對(duì)菌株降解效率的影響

以測(cè)試時(shí)間內(nèi)平均降解速率為目標(biāo)響應(yīng)值,各因素試驗(yàn)結(jié)果和模型預(yù)測(cè)值如表 2所示.利用SAS system軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸,得到回歸方程:

式中: Y為α-蒎烯的降解速率[mg/(L?h)], X1, X2,X3分別為NaCl、pH值和溫度的Code值.多元回歸方程的相關(guān)系數(shù) R2=0.9581,說(shuō)明該模型所預(yù)測(cè)的降解速率與實(shí)際降解速率具有很好的相關(guān)性.對(duì)上述多元回歸方程作二元響應(yīng)曲面,從而得到各個(gè)環(huán)境因素對(duì)降解速率的直觀影響圖(圖2).

表2 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值及預(yù)測(cè)值Table 2 The actual and predicted degradation rate by RSM

從圖2中可以看出,培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的降解活性有很大的影響.當(dāng) pH7、培養(yǎng)溫度25～30℃時(shí),降解活性達(dá)到最大值;pH值為酸性或堿性,抑或培養(yǎng)溫度較高或較低時(shí),菌株的降解活性均有不同程度地下降.由于一般石油廢水等工業(yè)污水中均含有一定的鹽度,因此在本試驗(yàn)中選擇了鹽濃度作為一個(gè)考察因素.鹽濃度不僅對(duì)于細(xì)胞的滲透壓具有一定的影響,而且還可影響細(xì)胞中脫氫酶和氧化酶的分泌 ,進(jìn)而影響細(xì)胞降解底物的能力.Diaz等[13]和Nicholson等[14]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),一些以碳?xì)浠衔餅樯L(zhǎng)碳源的微生物由于自身具有相應(yīng)的耐鹽酶系,從而能適應(yīng)一定的鹽度環(huán)境.但在本試驗(yàn)中,當(dāng)外界環(huán)境鹽度為0%時(shí),菌株利用底物的情況良好,隨著NaCl濃度的增加降解活性逐漸受到了抑制,表明菌株P(guān)T無(wú)法在一定的鹽度環(huán)境中生長(zhǎng).

圖2 環(huán)境因素對(duì)菌株降解速率的三維響應(yīng)面圖Fig.2 Three-dimensional surfaces of the environmental factors on the degradation rate

對(duì)回歸的二次多項(xiàng)式模型方程求一階偏導(dǎo),并令其等于零,可以求得最佳的環(huán)境因子,即當(dāng)NaCl濃度、pH值、溫度分別為0.00%、7.13和25.5℃時(shí),菌株 PT對(duì)于 α-蒎烯的降解速率達(dá)到最大值,為 5.35mg/(L?h).為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,在鹽度 0.00%、pH7.10、溫度 26℃時(shí)進(jìn)行了 3次搖瓶試驗(yàn),測(cè)定菌株 PT的平均降解速率分別為 5.21,5.18和 5.27mg/(L?h),均與預(yù)測(cè)值較為接近,可見(jiàn)所擬合的多元回歸方程能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)不同環(huán)境因子條件下菌株對(duì)于 α-蒎烯的平均降解速率.

2.3 菌株降解底物譜研究

在實(shí)際應(yīng)用中,常常是多種有機(jī)污染物共存,因此考察菌株P(guān)T對(duì)各種常見(jiàn)污染物的降解能力就顯得尤為重要.菌株P(guān)T對(duì)BTEX、石油醚、C6的同分異構(gòu)體及其他碳?xì)浠衔锏戎苯哟x的情況見(jiàn)表 3.菌株 PT幾乎可以不同程度地降解苯、甲苯、乙苯等 BTEX,以及石油醚、環(huán)己烯等碳?xì)浠衔?但不能代謝環(huán)己烷和正己烯.

表3 菌株P(guān)T對(duì)不同碳源的降解率與生物量Table 3 Biodegradation rates and biomass of different carbon source utilized by the strain PT

通常有機(jī)污染物的分子結(jié)構(gòu)、提供或接受電子的能力決定其化學(xué)穩(wěn)定性,影響微生物細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的吸附、轉(zhuǎn)移等能力,進(jìn)而決定有機(jī)物的可生物降解性[15].對(duì)于與母體化合物或代謝中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì),菌體一般都能不同程度地降解.α-蒎烯降解過(guò)程中可能產(chǎn)生檸檬油精(limonene)、對(duì)甲基異丙基苯(P-cymene)等中間代謝產(chǎn)物[16],這些物質(zhì)的分子中都含有類(lèi)似苯環(huán)的結(jié)構(gòu),菌株具有的相關(guān)酶系能夠有效地催化降解這種結(jié)構(gòu).由于BTEX的分子中都含有苯環(huán),因此菌株 PT能夠不同程度地降解這些物質(zhì),特別是對(duì)二甲苯,其結(jié)構(gòu)與對(duì)甲基異丙基苯非常相似,在6種苯系物中相同時(shí)間內(nèi)被代謝的程度是最高的.環(huán)己烯與檸檬油精都具有六元環(huán)結(jié)構(gòu),并且環(huán)內(nèi)含有C=C雙鍵,菌株P(guān)T對(duì)其的去除率達(dá)到了72.83%.而對(duì)于環(huán)己烷和正己烯,其結(jié)構(gòu)與 α-蒎烯或可能的代謝產(chǎn)物迥異,因此菌株無(wú)法利用這些物質(zhì).一般認(rèn)為,直鏈烷烴由于具有較小的空間位阻,可降解性大于相應(yīng)的支鏈烷烴[17-18].雖然石油醚(主要成分是戊烷和己烷)、十四烷,甲基乙基酮等化合物的結(jié)構(gòu)與α-蒎烯的差別較大,但這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單,或是直鏈烷烴,或是 C原子較少,因而菌株表現(xiàn)出了較強(qiáng)的利用能力.以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相應(yīng)分析表明,菌株 PT能降解一些常見(jiàn)的工業(yè)有機(jī)廢氣組分,對(duì)于降解底物具有一定的廣譜性.

2.4 降解動(dòng)力學(xué)研究

高濃度的有機(jī)污染物可能會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生一定的毒害作用,使其代謝過(guò)程變得緩慢甚至停滯.對(duì)不同初始濃度的底物降解過(guò)程考察發(fā)現(xiàn)(圖3),菌株P(guān)T的降解速率在一定濃度范圍內(nèi)隨著底物濃度的增加而增加,當(dāng)濃度超過(guò)200mg/L時(shí),抑制作用開(kāi)始發(fā)生,平均降解速率開(kāi)始緩慢下降.Haldane’s抑制生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型能較準(zhǔn)確地定量描述這種抑制作用[19],其表達(dá)式為:

式中: μ為菌株比降解速率, h-1; X為菌濃度,mg/L;t為時(shí)間, h; S為底物濃度, mg/L; Ks為半飽和系數(shù), mg/L; KI為抑制系數(shù), mg/L; μmax為最大比降解速率, h-1.

圖3 菌株降解α-蒎烯比降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Specific degradation kinetics curve for the strain PT degrading α-pinene

降解動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果如圖 3所示.擬合所得曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合程度較好,相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.9174.當(dāng)?shù)孜餄舛葹?22mg/L時(shí),比降解速率達(dá)到最大值0.0364h-1,相應(yīng)的半飽和系數(shù)Ks及抑制系數(shù) KI分別為 163.83mg/L和 317.62mg/L.Yoo等計(jì)算了假單胞菌Pseudomonas sp.strain PIN對(duì)于 α-蒎烯的比降解速率,其值約為 0.0102h-1,略低于本實(shí)驗(yàn)分離得到的菌株,表明 P. fluorescens PT 具有較好的降解α-蒎烯的能力.

2.5 代謝途徑初探

圖4 菌株降解過(guò)程中α-蒎烯濃度、TOC、生物量等參數(shù)的變化曲線Fig.4 Variation in the concentration of α-pinene, TOC value, biomass and the mineralization rates during the biodegradation process

2.5.1 降解過(guò)程中不同C形式的分析 通常,烷烴類(lèi)化合物在生物降解過(guò)程中能夠被轉(zhuǎn)化為醛酮、羧酸等羰基類(lèi)化合物,進(jìn)而被礦化為 CO2或是組成自身物質(zhì).菌株P(guān)T在降解100mg/L的α-蒎烯過(guò)程中,底物濃度、生物量積累、TOC生成等參數(shù)隨時(shí)間的變化如圖 4所示.隨著底物逐漸被降解,培養(yǎng)液中 TOC的含量呈上升的趨勢(shì),表明疏水性的 α-蒎烯轉(zhuǎn)化形成了水溶性的中間產(chǎn)物.通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液的 pH值進(jìn)行監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)有下降的趨勢(shì),表明水溶性的產(chǎn)物中有小分子有機(jī)酸成分.這與一些研究結(jié)果相類(lèi)似,即 α-蒎烯的可能降解產(chǎn)物為紫蘇酸(perillic acid)、對(duì)異丙基苯甲酸(cumic acid)等有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì),它們的積累會(huì)使培養(yǎng)液呈弱酸性[16].培養(yǎng)液中水溶性物質(zhì)的含量在α-蒎烯幾乎消耗盡35h后才達(dá)到最大值,這種滯后現(xiàn)象說(shuō)明降解過(guò)程中產(chǎn)生了一種疏水性的物質(zhì),這種物質(zhì)只有在α-蒎烯較低時(shí)才能被菌株代謝.培養(yǎng)液的TOC值隨著生物量的增大而逐漸減小,表明 PT能夠利用這些代謝產(chǎn)物,并最終達(dá)到礦化底物的效果而不僅僅是轉(zhuǎn)化[20].經(jīng)過(guò)相應(yīng)的計(jì)算,在140h時(shí),培養(yǎng)液中碳含量、菌體中增值的碳含量(干重 26g的生物質(zhì)大約含 1mol的碳) 、CO2中的碳含量分別為0.1779,2.6728和5.705mg,接近于消耗的總碳量(8.8mg),礦化率約為64.83%.Rittman等[22]研究發(fā)現(xiàn),有機(jī)化合物的生物降解過(guò)程通常包括物質(zhì)礦化和細(xì)胞物質(zhì)合成兩個(gè)方面,并指出生物量的表達(dá)式可用C5H7NO2表示,因此,通過(guò)化學(xué)計(jì)量法計(jì)算,菌株P(guān)T降解α-蒎烯的過(guò)程可表示為:

2.5.2 代謝途徑初探 靜息細(xì)胞法(resting cells是利用微生物細(xì)胞懸浮在只含有底物的去離子水或緩沖溶液中進(jìn)行生化反應(yīng)觀察其產(chǎn)物的研究方法,其優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)有效地控制培養(yǎng)基的成分,使某些產(chǎn)物得到大量積累,從而可以分析微生物代謝的過(guò)程[23].采用靜息細(xì)胞降解 α-蒎烯,利用衍生-GC/MS、離子色譜等分析方法對(duì)菌株降解過(guò)程的中間產(chǎn)物進(jìn)行定性分析,相應(yīng)的 GC/MS譜圖和離子色譜圖如圖5所示.在2.3.1中曾提及,在菌株的降解過(guò)程中可能產(chǎn)生了不溶于水的物質(zhì),從而致使TOC滯后現(xiàn)象出現(xiàn).通過(guò)GC/MS定性,發(fā)現(xiàn)此類(lèi)物質(zhì)是檸檬油精(limone),這在已有的報(bào)道中也有發(fā)現(xiàn).菌株 PT對(duì)檸檬油精的直接代謝和共代謝實(shí)驗(yàn)表明, PT可以利用檸檬油精作為碳源生長(zhǎng),但當(dāng) α-蒎烯與其共存時(shí),只有當(dāng)α-蒎烯濃度較低時(shí),培養(yǎng)液中的檸檬油精才能被菌株利用.Yoo等[4,16]采用Pseudomonas sp. strain PIN 轉(zhuǎn)化 α-蒎烯時(shí),發(fā)現(xiàn)只有當(dāng) α-蒎烯濃度較低時(shí),中間產(chǎn)物檸檬油精才能被代謝而濃度逐漸降低,同時(shí)以α-蒎烯為唯一碳源培養(yǎng)的菌株不能立即代謝檸檬油精,必須經(jīng)歷較長(zhǎng)的適應(yīng)期后才能利用檸檬油精作為生長(zhǎng)碳源.

根據(jù)檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,推測(cè)菌株P(guān)T對(duì)α-蒎烯的可能的代謝途徑如下(圖6):菌株含有的降解酶先攻擊分子結(jié)構(gòu)中的四元環(huán),開(kāi)環(huán)后形成檸檬油精(D1).檸檬油精是一種不溶于水的物質(zhì),其結(jié)構(gòu)中的甲基很容易被相應(yīng)的降解酶攻擊,經(jīng)歷一系列的氧化過(guò)程,形成相應(yīng)的有機(jī)酸—紫蘇酸(D2),從而驗(yàn)證了培養(yǎng)液的 TOC增大和pH 值下降的現(xiàn)象.隨后,氧分子在降解酶的催化下繼續(xù)攻擊六元環(huán)中的雙鍵,經(jīng)去碳酸基和羥基化作用,六元環(huán)開(kāi)環(huán)后形成二羥基化合物(D3)和直鏈烯烴,這些物質(zhì)極不穩(wěn)定,最終會(huì)被氧化為甲酸(D4)、乙酸(D5)和丙酮酸(D6),進(jìn)入TCA循環(huán)后或被礦化為CO2,或被合成自身細(xì)胞物質(zhì).

圖5 菌株降解α-蒎烯中間產(chǎn)物分析結(jié)果Fig.5 Analytical results of α-pinene metabolites produced by the strain PT

圖6 菌株降解α-蒎烯可能代謝途徑Fig.6 Proposed degradation pathway for the degradation of α-pinene by the strain PT

3 結(jié)論

3.1 選育到1株能高效降解α-蒎烯菌株P(guān)T,基于菌株形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析和 Biolog鑒定,可確定菌株 PT為Pseudomonas sp.(熒光假單胞菌).通過(guò)響應(yīng)面分析得出菌株最佳生長(zhǎng)條件:NaCl濃度、pH、溫度分別為 0.00%、7.13和 25.5℃時(shí),降解速率達(dá)到最大值,為 5.22mg/(L?h).

3.2 菌株P(guān)T能不同程度利用BTEX、石油醚、環(huán)己烷等工業(yè)常見(jiàn)的有機(jī)污染物,其降解α-蒎烯過(guò)程符合 Haldane’s抑制生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型.當(dāng) α-蒎烯濃度為222mg/L時(shí),比降解速率達(dá)到最大值0.0364h-1,相應(yīng)的半飽和系數(shù)Ks及抑制系數(shù)KI分別為163.83mg/L和317.62mg/L.

3.3 在生物降解過(guò)程中,菌株P(guān)T首先把α-蒎烯降解為檸檬油精,然后經(jīng)歷氧化、開(kāi)環(huán)等過(guò)程,形成紫蘇酸、2,3-二羥基丁二烯等物質(zhì),最終被氧化為甲酸、乙酸等小分子酸,進(jìn)入 TCA 循環(huán),形成CO2、H2O和自身組成物質(zhì).

[1] Corchonoy S B, Atkinson R. Kinetics of the gas-phase reactions of OH and NO3radicals with 2-carene 1,8-cineole, para-cymene and terpinolene [J]. Environmental Science and Technology,1990,24(10):1497-1502.

[2] Dirk F C, Allen D G. Development and simulation studies of an unsteady state biof i lter model for the treatment of cyclic air emissions of an alpha-pinene gas stream [J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2005,80(7):737-745.

[3] Tillmann R, Saathonff H, Brauers T, et al. Temperature dependence of the rate coefficient for the α-pinene reaction with ozone in the range between 243 K and 303 K [J]. Physical Chemistry Chemical Physics, 2009,11(13):2323-2328.

[4] Yoo S K, Day D F, Cadwallader K R. Bioconversion of α- and β-pinene by Pseudomonas sp. strain PIN [J]. Process Biochemistry, 2001,36(10):925-932.

[5] Savithiry N, Gage D, Fu W, et al. Degradation of pinene by Bacillus pallidus BR425 [J]. Biodegradation, 1998,9(5):337-341.

[6] Agrawal R, Joseph R. Bioconversion of alpha pinene to verbenone by resting cells of Aspergillus niger [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2000,53(3):335-337.

[7] Jin Y M, Veiga M C, Kennes C. Performance optimization of the fungal biodegradation of α-pinene in gas-phase biofilter [J].Process Biochemistry, 2006,41(8):1722-1728.

[8] 應(yīng) 佳,成卓韋,蔣軼鋒,等.生物過(guò)濾塔和生物滴濾塔凈化 α-蒎烯性能比較 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2010,30(6):1121-1129.

[9] 東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) [M]. 北京:科學(xué)出版社, 2001:370-399.

[10] Zhang L L, Zhu R Y, Chen J Y, et al. Seawater-retting treatment of hemp and characterization of bacterial strains involved in the retting process [J]. Process Biochemistry, 2008,43(11):1195-1201.

[11] Pires M N, Seldin L. Evaluation of biolog system for identification of strains of Paenibacillus azotofixans [J]. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 1997,71(3):195-200.

[12] Fan Y Z, Wang, Y Y, Qian P Y, et al. Optimization of phthalic acid batch biodegradation and the use of modified Richards model for modeling degradation [J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2004,53(1):57-63.

[13] Diaz M P, Boyd K G, Grigson S J W, et al. Biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotolerant bacterial consortium MPD-M, immobilized onto polypropylene fibers [J]. Biotechnology and Bioengineering,2002,79(2):145-153.

[14] Nicholson C A, Fathepure B Z. Biodegradation of benzene by halophilic and halotolerant bacteria under aerobic conditions [J].Applied and Environment Microbiology, 2004,70(2):1222-1225.

[15] Raymond J W, Rogers T N, Shonnard D R, et al. A review of structure-based biodegradation estimation methods [J]. Journal of Hazardous Materials, 2001,84(2/3):189-215.

[16] Yoo S K, Day D F. Bacterial metabolism of α- and β-pinene and related monoterpenes by Pseudomonas sp. strain PIN [J]. Process Biochemistry, 2002,37(7):739-745.

[17] 袁紅莉,楊金水,王占生,等.降解石油微生物菌種的篩選及降解特性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2003,23(2):157-161.

[18] 龐雅寧,趙國(guó)華,劉 磊,等.金剛石膜電極電化學(xué)氧化提高廢水可生化性的研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2009,29(12):1255-1259.

[19] Okpokwasili G C, Nweke C O. Microbial growth and substrate utilization kinetics [J]. African Journal of Biotechnology, 2006,5(4):305-17.

[20] 李蒙英,張 跡,陸 鵬,等.3,5-二硝基苯甲酸降解菌A3的分離及降解特性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2007,27(1):106-110.

[21] Prenafeta-Boldú F X, Vervoort J, Grotenhuis J T C, et al.Substrate interactions during the biodegradation of benzene,toluene, ethylbenzene, and xylene (BTEX) hydrocarbons by the fungus Cladophialophora sp. strain T1 [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002,68(6):2660-2665.

[22] Rittmann B, McCarty P. Environmental Biotechnology: Principles and Applications, first ed. [M]. New York: McGraw-Hill Education, 2000.

[23] Veeranagouda Y, Paul P V E, Gorla P, et al. Complete mineralisation of dimethylformamide by Ochrobactrum sp.DGVK1 isolated from the soil samples collected from the coalmine leftovers [J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,71(3):369-375.

Isolation and identification of an alpha-pinene-degrading bacterium and its degradation characteristics

CHENG Zhuo-wei1, GU Xin-na1, JIANG Yi-feng1*, CHEN Jian-meng2**, CHEN Jun1(1.College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China；2.Research Center of Environmental Engineering Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：622～630

An aerobic bacterium (strain PT) capable of degrading α-pinene was isolated from the biofilm of a biotrickling filter. Based on its morphology, physiological-biochemical characteristics, 16S rRNA gene sequence analysis and Biolog analysis, the strain PT was identified as Pseudomonas fluorescens. The results of response surface methodology (RSM)indicated that the initial conditions of NaCl concentration 0.00%, pH7.31 and temperature 25.5°C were optimal for its growth with the maximum biodegradation rate. Haldane’s kinetics model could be fit to the kinetics date well and the maximum specific degradation rate was 0.0364h-1. The strain PT could biodegrade several industrial contaminants which were characterized with simple or similar structures to that of α-pinene. GC/MS analysis showed that α-pinene was converted to some simple organic compounds (limonene, perillic acid etc.) by the strain PT, which was finally mineralized to CO2, H2O and synthesized to cell biomass. Analysis of carbon balance indicated that the rates for the mineralization and the biomass synthesis were about 64.83% and 30.37%, respectively.

α-pinene；biodegradation；kinetics analysis；mineralization rate；metabolic pathway

X172

A

1000-6923(2011)04-0622-09

2010-08-31

國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (2007BAE58B07);浙江省重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(R5090230);浙江省自然科學(xué)基金 (Y5080142)

* 責(zé)任作者, 副教授, jyf@zjut.edu.cn

** 責(zé)任作者, 教授, jchen@zjut.edu.cn

成卓韋(1982-),男,浙江杭州人,浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院博士研究生,主要從事大氣污染控制技術(shù)和典型污染物生物降解技術(shù)研究.發(fā)表論文10余篇.