陳翠珍，房 海，葛慕湘，王秀云

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066004)

錦鯉(Cyprinus carpio L．)在分類學(xué)上屬鯉科，為亞熱帶和溫帶地區(qū)的淡水魚類。因其體表漂亮的斑紋及優(yōu)美的游姿很具觀賞價(jià)值，我國(guó)人民從傳統(tǒng)民俗就賦予它吉祥、幸福的象征。因此，越來(lái)越多地博得廣大養(yǎng)魚愛(ài)好者的喜愛(ài)，也是我國(guó)高效益出口創(chuàng)匯魚種之一。由于其特定的水族箱或水池等養(yǎng)殖方式，常因環(huán)境因素等使一些疾病尤其是細(xì)菌引起的傳染病時(shí)有發(fā)生，造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

河北省秦皇島市某賓館水池養(yǎng)殖的觀賞用錦鯉，于2005年6月發(fā)生病害并偶有病死魚出現(xiàn)。病魚主要表現(xiàn)鱗片脫落、體表出血等癥狀。經(jīng)病原學(xué)檢驗(yàn)，認(rèn)為其為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)的混合感染所致;同時(shí)還檢出了可能作為參與者的吉氏庫(kù)特氏菌(Kurthia gibsonll)和瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii)［1，2］。筆者報(bào)告了2株弗氏檸檬酸桿菌的形態(tài)特征，主要理化性狀及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、病原學(xué)意義，藥物敏感性等方面的研究結(jié)果。

1 材料與方法

1．1 細(xì)菌分離與純培養(yǎng)

取病魚3尾及剛剛病死魚2尾共5尾進(jìn)行檢驗(yàn)，均表現(xiàn)在體側(cè)、鰭、頭部有不同程度出血，其中3尾的肛門處有出血，鱗片較大面積脫落;剖檢見(jiàn)有腸道臌氣，肝臟腫大、質(zhì)脆并有出血，均有不等量血樣腹水，2尾的腹內(nèi)有小的血塊，腹壁內(nèi)層肌肉出血。取其中剛剛病死2尾的肝組織為材料，先做抹片經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌;再劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h做細(xì)菌分離;待分離細(xì)菌后，選取不同菌落的一定數(shù)量，分別移接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面做成純培養(yǎng)(28℃培養(yǎng)24 h)供鑒定用。

1．2 細(xì)菌鑒定

取上述純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置28℃條件下培養(yǎng)20 h后制備成涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài);分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血液瓊脂(家兔脫纖血體積分?jǐn)?shù)為0．07的家兔脫纖血營(yíng)養(yǎng)瓊脂)檢查菌落特征;分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(管)中，置28℃培養(yǎng)24 h，檢查液體培養(yǎng)的生長(zhǎng)表現(xiàn);分別移接于細(xì)菌鑒定的相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行氧化酶、H2O2酶、糖(醇和苷)類代謝、吲哚、MR試驗(yàn)、V－P反應(yīng)、有機(jī)酸鹽利用、H2S產(chǎn)生、硝酸鹽還原等試驗(yàn)，較系統(tǒng)地測(cè)定其相應(yīng)理化特性［3］。

1．3 16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

取上述分離鑒定的1個(gè)菌株接種于LB肉湯中37℃培養(yǎng)16 h，按大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的“小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(批號(hào):DV810A)”所述方法提取DNA作為PCR模板DNA。

16S rRNA基因PCR擴(kuò)增的兩個(gè)引物分別為27F(正向引物):5′－AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG－3′;1492R(反向引物):5′－GGT TAC CTT GTT ACG ACT T－3′。在 20 μL 反應(yīng)體系中含有:無(wú)菌蒸餾水 14．4 μL，10 × PCR 緩沖液2 μL，1．5 mmol/L MgCl2 1．6 μL，4 × dNTP 混合物 0．4 μL，引物各0．2 μL，2．5×106U/L 的 Taq DNA 聚合酶0．2 μL，模板 DNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件為:96 ℃預(yù)變性3 min，接94℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后72℃溫育6 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化系統(tǒng)(Wizard PCR Preps，Promega)純化后，由上海博亞生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

將上述菌株的16S rRNA基因序列通過(guò) NCBI的 Blast檢索系統(tǒng)(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast/)進(jìn)行序列同源性分析，使用ClustalX1．83軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，采用鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．4 菌種歸類判定

根據(jù)對(duì)細(xì)菌形態(tài)、理化特性的檢驗(yàn)結(jié)果，主要依據(jù)《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology．9th ed》(1994)、Austin B 等《Bacterial Fish Pathogens:Disease of Farmed and Wild Fish》(1999)、《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology Volume 2》(2005)及有關(guān)資料［4～6］，并結(jié)合 16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的結(jié)果，進(jìn)行供試菌的種屬判定。

1．5 人工感染試驗(yàn)

擇上述分離并經(jīng)鑒定菌的代表菌株，移接于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯管37℃培養(yǎng)18 h后，制備成3×1011CFU/L的菌懸液，經(jīng)腹腔接種感染健康鯉魚6尾(每尾0．3 mL)，同時(shí)設(shè)立接種無(wú)菌普通營(yíng)養(yǎng)肉湯的對(duì)照鯉魚4尾。接種后隔離飼養(yǎng)于水族箱中，觀察其發(fā)病及死亡情況，對(duì)死亡魚及時(shí)檢查，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌分離和對(duì)分離菌做相應(yīng)的形態(tài)及理化特性等復(fù)核性檢驗(yàn)。以被感染魚發(fā)病或死亡并能重新分離回收到原感染菌為供試菌株的病原性判定指標(biāo)，對(duì)照魚應(yīng)在觀察期內(nèi)正常存活。

1．6 藥物敏感性測(cè)定

取經(jīng)鑒定的純培養(yǎng)菌株，采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散(K－B)法進(jìn)行對(duì)常用抗菌類藥物的敏感性測(cè)定，以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標(biāo)［7］。

2 結(jié) 果

2．1 細(xì)菌分離與純培養(yǎng)情況

在2尾魚的肝組織中，均見(jiàn)有較多量革蘭氏染色陰性桿菌，在其中1尾中還偶見(jiàn)革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌。做細(xì)菌分離，結(jié)果分離到4種細(xì)菌的菌落(分別記作A，B，C，D)。其中A菌從2尾魚中均分離到且呈優(yōu)勢(shì)態(tài)，經(jīng)鑒定為維氏氣單胞菌;C菌僅從其中1尾分離到幾個(gè)菌落，經(jīng)鑒定為吉氏庫(kù)特氏菌;D菌從2尾均分離到，但僅有很少菌落，經(jīng)鑒定為瓊氏不動(dòng)桿菌;B菌即為本次所鑒定的弗氏檸檬酸桿菌。該菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，菌落呈圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、淺灰白色、半透明至不透明，培養(yǎng)24 h直徑多在大約1．3 mm。取每尾魚分離菌落各1個(gè)做純培養(yǎng)共2株，按分離地、日期及株數(shù)編號(hào)為HC050630B－1，HC050630B－2。

2．2 分離菌的主要生物學(xué)性狀及細(xì)菌種類

2．2．1 形態(tài)特征 2株純培養(yǎng)菌形態(tài)特征一致，均為革蘭氏染色陰性、桿狀(有的近似球桿狀)、散在、個(gè)別的成雙、兩端鈍圓、無(wú)芽孢、大小多在0．5 ～0．8 μm ×1．0 ～1．8 μm 的細(xì)菌。

2．2．2 菌落特征 2株純培養(yǎng)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落特征和生長(zhǎng)情況，與從病料中直接分離的相一致，培養(yǎng)48 h的菌落直徑約為1．8 mm;在血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的與在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的相同，不溶血。

2．2．3 在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)情況 在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，2株菌生長(zhǎng)表現(xiàn)一致，均呈均勻混濁生長(zhǎng)，管底有少量絮狀沉淀(搖動(dòng)后即消散)，形成輕度菌環(huán)(搖動(dòng)后易消散)。

2．2．4 理化特性 2株純培養(yǎng)菌對(duì)所測(cè)項(xiàng)目結(jié)果一致(表1)。

2．2．5 16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育學(xué) 用HC050630B－1菌株所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度1 458 bp，在GenBank中登錄號(hào)為EF669481。將HC050630B－1株的16S rRNA基因序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性檢索，結(jié)果其與檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)細(xì)菌的16S rRNA基因序列自然聚類，在檢索出的檸檬酸桿菌屬細(xì)菌序列中，該菌株與它們的同源性在99%。選取了其中19株細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果其與弗氏檸檬酸桿菌聚為一分支，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

表1 2株分離菌的理化特性

2．3 人工感染的致病作用

擇上述鑒定的弗氏檸檬酸桿菌HC050630B－1株，對(duì)健康鯉魚的感染試驗(yàn)。結(jié)果供試6尾魚感染后96 h和120 h各死亡1尾，剖檢見(jiàn)肝臟不同程度的腫脹、腹腔內(nèi)有血樣腹水、腸管充血或有出血，其余4尾觀察14 d未見(jiàn)發(fā)病;對(duì)照4尾觀察14 d均正常存活。

取其中1尾感染死亡魚的肝組織做細(xì)菌分離與檢驗(yàn)，結(jié)果分離到原感染菌。

2．2．6 細(xì)菌種類 上述檢驗(yàn)結(jié)果表明，所分離鑒定的2株菌為同種細(xì)菌。依據(jù)其形態(tài)與培養(yǎng)特性、理化特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的結(jié)果，判定為檸檬酸桿菌屬的弗氏檸檬酸桿菌。

圖1 16S rRNA基因序列分析聚類圖

2．4 藥物敏感性

取上述經(jīng)鑒定的弗氏檸檬酸桿菌HC050630B－1菌株，做對(duì)37種抗菌類藥物的敏感性測(cè)定。結(jié)果表現(xiàn)對(duì)供試的頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南、阿奇霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、大觀霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶等21種藥物呈現(xiàn)高度敏感或敏感(抑菌圈直徑在16～28 mm)，對(duì)頭孢唑啉、頭孢拉啶、多黏菌素B、呋喃唑酮、呋喃妥因等5種呈低度敏感(抑菌圈直徑在10～14 mm);對(duì)四環(huán)素、多西霉素、青霉素G、氨芐青霉素、苯唑青霉素、利福平、紅霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、新生霉素、桿菌肽等11種耐藥(無(wú)抑菌圈形成)。

3 討 論

由弗氏檸檬酸桿菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物病害已有較多報(bào)道，如舒新華等［8］報(bào)道了養(yǎng)殖烏鱧由該菌引起的腹水病，陳翠珍等［9］、李華等［10］報(bào)道了該菌引起的中華絨螯蟹感染，Sato等［11］報(bào)道了該菌引起水族箱養(yǎng)殖的翻車鲀(Sunfish，Mola mola)感染發(fā)病，Baya［12］報(bào)道該菌在西班牙引起大西洋鮭感染發(fā)病，Sanz［13］報(bào)道在美國(guó)由該菌引起的虹鱒感染發(fā)病。在錦鯉的細(xì)菌性感染方面，李煥榮等［14］報(bào)道由嗜水氣單胞菌引起的錦鯉發(fā)病，病魚主要表現(xiàn)鱗片脫落、肛門紅腫，內(nèi)臟色黃質(zhì)脆、腸粘膜充血等癥狀;莫介化等［15］報(bào)道由溫和氣單胞菌引起的錦鯉出血癥;陸小萏等［16］從患病錦鯉分離到摩氏摩根氏菌;Asutin B等［17］報(bào)道曾從發(fā)病錦鯉分離到米氏鏈球菌等，由弗氏檸檬酸桿菌引起的錦鯉感染發(fā)病尚少有報(bào)道。

本次所檢錦鯉病例，缺乏特征性的臨床表現(xiàn)及剖檢變化，病魚主要表現(xiàn)食欲減退、游動(dòng)緩慢，鱗片脫落，體表充血及出血等;剖檢所見(jiàn)肝、腎腫脹、出血等敗血癥變化。經(jīng)做細(xì)菌檢驗(yàn)，認(rèn)為是一種細(xì)菌性混合感染癥，其中主要是維氏氣單胞菌，其次為弗氏檸檬酸桿菌;吉氏庫(kù)特氏菌和瓊氏不動(dòng)桿菌缺乏明顯的病原學(xué)意義。另一方面，經(jīng)對(duì)健康鯉魚所做人工感染試驗(yàn)，表明所檢出的弗氏檸檬酸桿菌具有一定的致病作用，可單獨(dú)引起感染鯉魚的發(fā)病與死亡，并從感染死亡魚中重新分離到原感染菌，也初步表明了該菌在所檢錦鯉病例中的相應(yīng)病原學(xué)意義，并認(rèn)為該菌單獨(dú)也可能會(huì)引起錦鯉感染發(fā)病。

本次經(jīng)以37種抗菌類藥物對(duì)分離菌的藥敏測(cè)定，其結(jié)果有助于選擇用藥防治，同時(shí)亦可供對(duì)弗氏檸檬酸桿菌耐藥譜等研究的參考。

［1］陳翠珍，張曉君，房海，等．錦鯉中瓊氏不動(dòng)桿菌的分離與鑒定［J］．水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2(1):86－90．

［2］陳翠珍，房海，張曉君，等．錦鯉中吉氏庫(kù)特菌的分離與鑒定［J］．微生物學(xué)雜志，2010，30(1):1－5．

［3］東秀珠，蔡妙英．常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］．北京:科學(xué)出版社，2001．

［4］HOLT J G，KRIEG N R，SNEATH P H A，et al．Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology［M］．9th ed．Baltimore:Williams and Wilkins，1994．

［5］AUSTIN B，AUSTIN D A．Bacterial Fish Pathogens:Disease of Farmed and Wild Fish［M］．Third Rev ed．Chichester，UK:Praxis Publishing Ltd，1999．

［6］GARRITY G M．Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology［M］．Second ed．Volume Two．New York:Part B Springer，2005．

［7］葉應(yīng)嫵，王毓三．全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］．2版．南京:東南大學(xué)出版社，1997．

［8］舒新華，金燮理，肖克宇，等．烏鱧腹水病病原的分離和鑒定［J］．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，2(4):286－290．

［9］陳翠珍，張曉君，房海，等．中華絨螯蟹病原弗氏檸檬酸桿菌的鑒定［J］．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22(2):136－141．

［10］李華，刑殿樓，白國(guó)福，等．弗氏檸檬酸桿菌對(duì)河蟹致病性的研究［J］．水生生物學(xué)報(bào)，2001，25(3):217－223．

［11］SATO N，YAMANE N，KAWAMURA T．Systemic Citrobacter freundii infection among sunfish Mola mola in Matsushima aquarium［J］．Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1982，48:1 551－1 557．

［12］BAYA A M，LUPIANI B，HETRICK F M．Increasing importance of Citrobacter freundii as a fish pathogen［J］．Fish Health Section American Fisheries Society Newsletter，1990a，18:4．

［13］SANZ F．Rainbow trout mortalities associated with a mixed infection with Citrobacter freundii and IPN virus［J］．Bulletin of the European Association of Fish pathologists，1991，11:222．

［14］李煥榮，崔德鳳，張耳，等．錦鯉致病性嗜水氣單胞菌分離和藥敏試驗(yàn)［J］．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24(3):205－208．

［15］莫介化，李春枝，張邦杰，等．錦鯉爆發(fā)性出血癥病源的研究［J］．水產(chǎn)科技情報(bào)，2002，29(6):280－283．

［16］陸小萏，鄒偉民，譚愛(ài)萍，等．錦鯉摩氏摩根氏菌的鑒定及致病性研究［J］．淡水漁業(yè)，2005，35(2):3－5．

［17］AUSTIN B，ROBERTSON P A W．Recovery of Streptococcus milleri from ulcerated koi carp(Cyprinus carpio L．)in the UK［J］．Bulletin of the European Association of Fish pathologists，1993，13:207－209．