王旭東,姜洪偉,張 偉,王海珠,朱寶平,陳 明,梁國棟,徐 華

(1.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院普通外科,吉林長春130041;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院腫瘤科;3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是我國較常見的嚴重危害人民健康的惡性腫瘤之一,世界范圍的流行病學(xué)調(diào)查資料表明,在各類惡性腫瘤中,結(jié)直腸癌的發(fā)病率占第3位,僅次于胃癌和肺癌的第三位惡性腫瘤,結(jié)直腸癌已成為危害人們身體健康的嚴重疾病。腫瘤發(fā)生、發(fā)展是多基因、多階段的過程,癌基因的激活與抑癌基因的失活及異常被認為是腫瘤的發(fā)生的重要的分子機制。結(jié)直腸癌治療方式主要是手術(shù)治療,術(shù)前化療,放療可使腫瘤縮小,術(shù)后化療,放療可預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,而化療藥如何使抑癌基因發(fā)揮抑癌效應(yīng)是目前研究熱點[1],本文就常用化療藥(順鉑和5氟尿嘧啶)對結(jié)直腸癌細胞株SW1116DCC基因影響加以闡述。

1 材料與方法

1.1 標本 SW1116細胞株購自中科院上海生物研究所。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent(Invitrogen公司)。Taq DNA聚合酶,dNTP,DL2000 DNA Marke,AMV Reverse Transcriptase,Low Protein Marker(均購自寶生物工程有限公司)。RNase抑制劑;丙烯酰胺;N,N'-亞甲雙丙烯酰胺;N,N,N,N'-四甲基乙二胺;十二烷基硫酸鈉(SDS);四甲基乙二胺(TEMED)均購自Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞的化療藥處理方法 取對數(shù)生長期的SW1116細胞,計數(shù),調(diào)細胞濃度5×105,加入6孔板,分別加入 3.0 μ g/ml的 DDP,260 μ M 的 5-Fu。作用6 h、12 h、24 h后,提取細胞的mRNA和蛋白備用。

1.3.2 化療藥對DCC基因的影響 引物的設(shè)計與合成:嚴格按照引物設(shè)計原則。本研究所用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。上游引物:5′-AAGCTTCCGCCACCATGACAGTCTTGGTTCCGCCATG-3′,下游引物:5′-CTCTCTCTCGAGCTAACTGGAGCTTGGGATAGCAGGC-3′。

我們采用RT-PCR法研究常用化療藥對DCC基因轉(zhuǎn)錄的影響,采用Western-Blot法化療藥對DCC蛋白表達的影響。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的轉(zhuǎn)錄影響見圖1。從圖1可以看出,以RT-PCR法雜交出的特異性條帶的灰度值高低來判斷不同化療藥物作用不同時間對結(jié)直腸癌細胞株SW1116中DCC基因轉(zhuǎn)錄的影響。順鉑和5-氟尿嘧啶可以促進DCC基因轉(zhuǎn)錄的表達,6小時開始上升,12小時表達量最高,隨著時間的增加,DCC基因的轉(zhuǎn)錄開始下降,細胞生長明顯減慢,24小時達低值。

圖1 RT-PCR法檢測 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的轉(zhuǎn)錄

2.2 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的蛋白影響 見圖2。從圖2可以看出:western blot雜交出的特異性條帶的灰度值高低來判斷不同化療藥物作用不同時間對結(jié)直腸癌細胞株SW1116中DCC蛋白表達的影響。順鉑和5-氟尿嘧啶作用結(jié)直腸癌細胞株SW1116,可以促進DCC蛋白的表達,并且在6小時DCC蛋白表達開始上升,12小時更加明顯,表達量最高,細胞生長明顯減慢,24小時達低值。結(jié)果表明DCC基因表達水平降低或缺失在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能起了重要的作用,尤其對大腸癌細胞轉(zhuǎn)移浸潤過程的影響更為明顯,說明常用化療藥物可通過使癌細胞表達DCC量的上升來實現(xiàn)其抗癌作用。

圖2 Western-Blot法檢測DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的蛋白表達

3 討論

DCC基因定位于人染色體18q21.3,全長300-400 kb,至少含有28個外顯子,cDNA長約4 341 bp。Cho等從基因庫里分離出含所有已知編碼序列的噬菌體,克隆其完整全長1.4 Mb,確定了第29號外顯子的存在,并確定了每個內(nèi)外顯子的邊界序列。DCC基因的表達蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由1447個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為190 KD,該蛋白主要包括3個功能區(qū),即胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),該膜糖蛋白在許多研究中被指出與細胞分化有關(guān)。該基因為腫瘤抑制基因[2]。該基因的最重要的功能已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)中被描述為netrin-1的受體。結(jié)腸癌缺失基因敲出的小鼠證實了這個基因在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的一個很重要的角色,然而質(zhì)疑了該基因在腫瘤抑制的意義和作為黏液受體方面的不同。結(jié)腸癌缺失基因轉(zhuǎn)染HT-29人結(jié)腸細胞會增加細胞之間的黏附性,損害細胞之間的物質(zhì)交換,細胞和細胞之間以及細胞和基質(zhì)之間黏附結(jié)構(gòu)在不同組織之間細胞正常結(jié)構(gòu)的保持和發(fā)展有關(guān)的遷移起著重要作用,以及組織重構(gòu)和病理狀態(tài),連接復(fù)合體連接著細胞外基質(zhì)的配體和鄰近細胞為骨架提供細胞表面的化學(xué)信號提供分子支持。在人體上,細胞外骨架蛋白細胞外基質(zhì)和鄰近細胞連接起來,特別是在信號傳導(dǎo)中。一個大的黏附蛋白家族包含著免疫球蛋白,以各種各樣的免疫球蛋白和纖維蛋白III的出現(xiàn)為特征。發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的軸突導(dǎo)向有關(guān),并且是細胞凋亡的誘導(dǎo)因子之一。這些基因編碼細胞內(nèi)轉(zhuǎn)換子,作用于TGF-β配體家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。

5-FU對腫瘤殺傷作用的強弱,直接與抑制胸苷酸合成酶的程度有關(guān),亦即決定于三元復(fù)合物的穩(wěn)定性。順鉑的活性受溶液中的氯離子的影響極大,在生理鹽水中其活性在24小時以上是穩(wěn)定的,但是在不含氯離子的溶液中,其活性每小時減少10%[4]。順鉑在體液條件下,由于體液的氯離子濃度高,它大部分以原型化合物的形式存在,但是當其進入低氯離子濃度的細胞內(nèi),其氯基被代謝。代謝產(chǎn)物荷正電,它具有類似于烷化劑雙功能基團的作用,與細胞內(nèi)的親核基團結(jié)合,主要與DNA鏈上的堿基作用,與堿基結(jié)合形成三種形式的交聯(lián),改變其作為正常復(fù)制模板的功能,造成DNA的損傷,破壞DNA的復(fù)制,誘導(dǎo)細胞的凋亡,阻斷細胞周期的G2期,它還可以間接促進機體免疫而產(chǎn)生細胞毒作用[5]。

本實驗研究表明:采用RT-PCR法和western blot法雜交出的特異性條帶的灰度值高低來判斷不同化療藥物作用不同時間對結(jié)直腸癌細胞株SW1116中DCC基因的影響。從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平觀察:順鉑和 5-氟尿嘧啶作用結(jié)直腸癌細胞株SW1116,可以促進DCC基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,并且在6小時DCC蛋白開始上調(diào),12小時更加明顯,表達量最高,細胞生長明顯減慢,24小時達低值。結(jié)果表明DCC基因表達水平降低或缺失在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能起了重要的作用,尤其對大腸癌細胞轉(zhuǎn)移浸潤過程的影響更為明顯,說明常用化療藥物可通過使癌細胞表達DCC量的上升來實現(xiàn)其抗癌作用。成為大腸癌基因治療的一個有效靶基因。

[1]Kim TH,Lee H K,Seo IA,et al.Netrin induces down regulation of its receptor,Deleted in Colorectal Cancer,through the ubiquitin proteasome pathway in the embryonic cortical neuron[J].J Neurochem JT Journal of neurochemistry,2005,95(1):1.

[2]龍陳艷,唐衛(wèi)中.DCC基因與結(jié)直腸癌的研究進展[J].結(jié)直腸肛門外科,2009,15(6):431.

[3]Sarah Derks,Linda J.W.Bosch et al.Promoter CpG island hyper methylation and H3K9me3 and H3K27me3-mediated epigenetic silencing targets the deleted in colon cancer(DCC)gene in colorectal carcinogenesis without affecting neighboring genes on chromosomal region 18q21[J].Carcinogenesis,2009,30(6)1041.

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