李海偉，陳云琳，黃 笛，聞建平

（1北京交通大學(xué)理學(xué)院，北京 100044；2天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

進展與述評

飛秒激光誘變微生物技術(shù)及其機理的研究進展

李海偉1，陳云琳1，黃 笛2，聞建平2

（1北京交通大學(xué)理學(xué)院，北京 100044；2天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

飛秒激光誘變微生物是一項嶄新的技術(shù)。本文針對傳統(tǒng)低功率 He-Ne激光誘變微生物的優(yōu)點和缺點，結(jié)合飛秒激光光束脈沖持續(xù)時間短、瞬時功率大、聚焦尺寸小的優(yōu)點，簡要概括了國內(nèi)外對飛秒激光誘變微生物技術(shù)的研究。同時對飛秒激光輻射微生物過程中多光子吸收、形成等離子體、產(chǎn)生生物活性氧、DNA損傷自身修復(fù)等一系列的機理研究進行了總結(jié)。最后，對飛秒激光誘變微生物技術(shù)及其機理研究進行了展望并提出了建議：結(jié)合關(guān)鍵酶活性測定和動力學(xué)參數(shù)測定來選擇飛秒激光誘變的技術(shù)參數(shù)。

飛秒激光；誘變；微生物；機理

Abstract：Femtosecond laser induced micro-organisms mutation has become a new microbial technology，because of its characteristics of ultrafast pulse，high peak power and focusing on a small size. In this paper，compared to the advantages and disadvantages of the traditional low-power He-Ne laser irradiation，the technology of femtosecond laser induced micro-organisms mutation is discussed. Meanwhile，compared to traditional laser mutation mechanism of micro-organisms，the mechanisms of multi-photon absorption，formation of plasma，formation of reactive oxygen species，DNA damage and self-repair are summarized. Finally，the prospect for technology of femtosecond laser induced micro-organisms mutation is given，and the combination of key-enzyme activity measurement and dynamics parameters determination is important in choosing the technological parameters of femtosecond laser induced micro-organisms mutation.

Key words：femtosecond laser；inducing；micro-organism；mechanism

目前，微生物在解決人類的糧食、能源、健康、資源和環(huán)境保護等問題中正發(fā)揮著越來越重要且不可代替的獨特作用，也為人類帶來了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益[1]。為了獲得高產(chǎn)、低耗、優(yōu)質(zhì)的菌種，人們常常通過外界物理、化學(xué)、生物因子等因素的改變誘發(fā)基因突變，其中激光誘變以其處理安全、設(shè)備簡單、操作方便、輻射損傷輕、誘變當(dāng)代即可變異等優(yōu)點[2]越來越受到研究者的青睞，且應(yīng)用此方法人們已經(jīng)得到了大量的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種[3-7]。但是，傳統(tǒng)低功率長脈沖He-Ne激光誘變方法存在易損傷細胞活性、突變效率低、突變無方向性、育種周期長等缺陷，易造成細胞活性損傷致死[8]、后續(xù)篩菌工作量大、菌種退化[9]等。

飛秒激光由于其脈沖持續(xù)時間短（10?15s）、瞬時功率大（1012W）、聚焦尺寸?。s200 nm）的特點，迅速成為激光誘變微生物獲得優(yōu)質(zhì)菌株的一種新技術(shù)，具有潛在的、誘人的誘變效果，且人們已經(jīng)應(yīng)用飛秒激光誘變微生物得到了變異優(yōu)質(zhì)菌種[10]。由于飛秒脈沖時間與微觀生物化學(xué)反應(yīng)過程時間相同，所以依靠超快過程能夠徹底了解生物化學(xué)反應(yīng)過程[11]。該新技術(shù)利用飛秒激光高峰值功率、聚焦尺寸小的特點，能避免光學(xué)衍射極限，輻照微生物細胞時可以實現(xiàn)直接照射細胞靶點進行染色體定點切割[12]和單細胞顯微操作[10]等。另外，由于生物大分子和水幾乎不吸收近紅外光，應(yīng)用近紅外飛秒激光技術(shù)對微生物菌種進行誘變作用，可以在不損傷細胞活性的前提下，對微生物菌株進行飛秒激光誘變技術(shù)的研究[13]。在飛秒激光誘變微生物機理研究方面，人們提出了許多不同的解釋，雖然各自針對的生物化學(xué)過程不同，機理解釋也有差別，但也形成了一些各不相同的、較成熟的機理解釋，比如生物分子多光子吸收[14]、形成等離子體[15]、產(chǎn)生生物活性氧[16]、微生物細胞自身修復(fù)[17]等理論解釋，但是缺乏唯一的、可信的飛秒激光誘變機理解釋。

本文結(jié)合飛秒激光的特點和飛秒激光誘變微生物技術(shù)優(yōu)勢，圍繞飛秒激光誘變微生物實驗技術(shù)應(yīng)用和機理的研究展開評述，并對該領(lǐng)域的研究進行了展望。

1 飛秒激光誘變微生物實驗技術(shù)

1.1 飛秒激光光束特點

1981年，美國貝爾實驗室的Fork等報道了脈沖碰撞鎖模激光器的實驗結(jié)果，將激光脈沖寬度推進到飛秒量級。20世紀90年代以后，隨著飛秒鈦寶石（Ti∶Al2O3）激光器的研制成功，人們獲得了峰值功率高、脈沖極短的飛秒激光，新一代光子晶體光纖飛秒激光研究也于2000年后蓬勃發(fā)展起來。隨著飛秒激光技術(shù)的發(fā)展，近紅外飛秒激光在生物學(xué)上的應(yīng)用日益增多[18]。飛秒激光光束的特點主要有脈沖寬度短、瞬時功率大、聚焦尺寸小等，具體見表1所示。

1.2 飛秒激光誘變微生物技術(shù)優(yōu)勢

飛秒激光光束有著與其它激光光束不同的特點，從而使其在微生物誘變方面有著獨特的優(yōu)勢。

表1 飛秒激光光束的主要特點

（1）脈沖時間與生物化學(xué)反應(yīng)時間相同 飛秒（10－15s）超短的時間范圍正好是基本的化學(xué)反應(yīng)和分子內(nèi)電子和原子核運動的時間范圍，如化學(xué)反應(yīng)中化學(xué)鍵的形成或斷裂，分子重排形成新分子，能量從一個分子傳遞到另一個分子等過程。隨著Zewail[11]最早利用飛秒激光研究化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)過程而被授予1999年的諾貝爾化學(xué)獎，人們已經(jīng)在飛秒化學(xué)生物領(lǐng)域有了較大進步[19]，尤其飛秒技術(shù)已經(jīng)被用于研究 DNA中電荷傳遞及質(zhì)子傳遞過程[20]。所以超短飛秒脈沖輻射微生物細胞時能從微觀角度影響到生物新陳代謝過程中各種生物化學(xué)反應(yīng)，從而促進變異概率的提高。

（2）高能光子與生物組織作用強烈 飛秒激光由于其高峰值功率，在與微生物細胞相互作用時引起細胞器或細胞內(nèi)分子對激光能量的非線性吸收，這種非線性吸收在焦點處產(chǎn)生高激發(fā)的等離子體[15]。由于在等離子體產(chǎn)生的過程中會產(chǎn)生活性自由基，它們易與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶和DNA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，影響生物代謝，從而增強了變異的效果。

（3）DNA定點切除 近紅外飛秒激光系統(tǒng)（重復(fù)頻率為80 MHz，波長為800 nm，能量2 nJ）已被用于破壞人類染色體上的高濃縮的DNA和單個伸展的DNA分子的染色體組[18]。對于微生物（尤其原核生物）來說，由于DNA分子只有一條或者幾條，又由于飛秒激光聚焦小，在顯微鏡下可以對微生物的DNA進行飛秒激光定點切除、移植等操作[12，21]。此種方法針對性強、精確度高，使突變更有目的性，避免了目前大多激光誘變“黑箱子操作”的盲目性，能夠有效的減少后續(xù)高通量篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的工作量。

（4）細胞損傷小 大多數(shù)細胞在700～1100 nm波長范圍內(nèi)吸收系數(shù)小，散射系數(shù)小，因而幾乎是透明的，因此近紅外飛秒激光對細胞的穿透深。并且當(dāng)飛秒激光聚焦于微生物細胞時，聚焦處的光強非常高，足以引起非線性吸收，但聚焦處附近的熱影響非常小，飛秒激光對鄰近細胞幾乎沒有損害（溫度升高小于10－5K）[22]，且不影響細胞活性，而紫外和可見光不僅穿透深度小，且對活細胞的損壞嚴重。

1.3 飛秒激光誘變微生物實驗技術(shù)

雖然飛秒激光在微生物誘變領(lǐng)域有很大的優(yōu)勢，但是，由于飛秒激光價格昂貴，實驗環(huán)境及實驗操作要求嚴格等因素，國內(nèi)外關(guān)于飛秒激光誘變微生物獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的實驗技術(shù)還很少。目前，據(jù)文獻報道，飛秒激光誘變技術(shù)主要有以下成果。

（1）飛秒激光誘導(dǎo)細胞融合技術(shù) 20世紀80年代中期，美國貝爾實驗室的Ashkin等[23]發(fā)現(xiàn)，高度匯聚的高斯激光束能捕獲單細胞，后來被發(fā)展為用于操作細胞和細胞器的工具——激光鑷子。飛秒激光具有極高的時間（10－15s）和空間（約200 nm）分辨率，并可以高精度地控制能量與時間，鞏繼賢等[10，24]利用飛秒激光作為光源實現(xiàn)了集光鑷與細胞手術(shù)為一體的飛秒激光單細胞顯微操作系統(tǒng)，利用55 mW的飛秒激光（中心波長為810 nm，脈沖重復(fù)頻率100 MHz，脈沖寬度為40 fs）作用0.25秒，使兩株紅發(fā)夫酵母（P.rhodozyma）原生質(zhì)體（P-EUN-I-19和P-EUN-D-08）發(fā)生融合，得到的融合體菌株（P-S-Ⅱ-19）發(fā)酵產(chǎn)量比 P-EUN-I-19紅發(fā)夫酵母菌株提高了64%[25]。圖1為兩株紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)體飛秒激光誘導(dǎo)后的融合過程[10]。圖1(a)所示為采用功率為50～100 mW的飛秒光束，照射細胞膜緊密接觸區(qū)域67.5～250 ms后兩個細胞開始融合，23 min后，明顯看到細胞融合的現(xiàn)象[圖1(b)]，90 min后，觀察不到兩個細胞的邊緣[圖1(c)]，細胞呈啞鈴狀，160 min后，兩個細胞融合為一個細胞[圖 1(d)]。該技術(shù)成果有望成為單細胞操作實現(xiàn)高效細胞融合的技術(shù)手段，將兩株近親細胞雜交得到優(yōu)良品種，同時不損傷細胞活性。超短脈沖飛秒激光誘導(dǎo)細胞融合具有選擇性好、融合率高、可視操作、無需進行融合子檢出操作等優(yōu)勢[25]。

圖1 細胞原生質(zhì)體融合過程[10]

（2）飛秒激光轉(zhuǎn)染技術(shù) UdayK Tirlapur[26]和用鈦藍寶石飛秒激光器在細胞膜上產(chǎn)生單個的、特定位置的、瞬時的、可逆的穿孔，它允許 DNA通過，并能保持細胞的完整性，而后UdayK Tirlapur用飛秒激光在中國鼠的卵巢（CHO）和袋鼠的腎上皮細胞（PtK2）內(nèi)進行DNA轉(zhuǎn)染。Zeira等[27]利用鈦藍寶石飛秒激光脈沖將裸 DNA傳遞到嚙齒動物的肌肉組織。但是目前沒有飛秒激光誘導(dǎo)微生物DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的報道。這種技術(shù)不僅轉(zhuǎn)染效率高，可以同時觀察到外源基因的整合和表達，具有高精確度，高效性的優(yōu)點，必將成為研究熱點之一。

（3）DNA基因定點切除技術(shù) 飛秒激光光束聚焦斑點半徑可達 100 nm，峰值功率密度可達1018～1020W/cm2，光強大到足以產(chǎn)生等離子體，將聚焦處的生物組織氣化，所以激光切割的孔可以在目標(biāo)物100 nm以下的尺寸內(nèi)產(chǎn)生。Halbhuber[12]和Karsten K?nig等[28]用飛秒激光進行了人體染色體切割實驗，切割尺度分別為100 nm 和85 nm。該技術(shù)成果表明，應(yīng)用飛秒激光在顯微鏡下可以針對染色體上某處基因位點進行切割、移植等操作，得到所需的微生物變異體；同時，將某處基因切除后有利于研究DNA該段堿基的生物功能，研究DNA損傷與修復(fù)的機理。

目前，飛秒激光主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利用飛秒光鑷與飛秒光刀進行生物細胞微加工、線粒體切割[29]、生物標(biāo)記物成像[30]、生物細胞三維高分辨率顯示[31]、生物化學(xué)反應(yīng)微觀過程[32]、眼睛角膜矯正手術(shù)[33]等。但是，目前國內(nèi)外激光誘變均是用連續(xù)或長脈沖激光對細胞群體進行照射，應(yīng)用飛秒激光輻照微生物使其發(fā)生變異的文獻報道甚少。由于飛秒激光高峰值功率的特點，用飛秒激光進行微生物細胞的誘變操作，其效果要比傳統(tǒng)的連續(xù)或長脈沖激光作用于細胞群體更加劇烈、有效，所以飛秒激光誘變微生物實驗的開展必將填補國內(nèi)外該領(lǐng)域的空白。

2 飛秒激光誘變微生物機理

一般認為，激光對遺傳物質(zhì)的影響主要分為直接作用和間接作用[34]。直接作用是指激光能引起染色體產(chǎn)生缺失、重復(fù)、倒位和異位等結(jié)構(gòu)；間接作用是指激光光子使能量在染色體及 DNA分子周圍聚集，引起分子加劇運動和變化，從而使 DNA分子產(chǎn)生突變。但是此種解釋只是從直觀的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果出發(fā)，提出實驗解釋，缺乏微觀的、更深層次的理論研究。

激光誘變育種的機理后來從物理與數(shù)學(xué)角度作了研究，用量子理論、非線性理論研究了激光與DNA作用。周凌云等[35-37]在一維蛋白質(zhì)分子鏈模型的基礎(chǔ)上，用量子力學(xué)及非線性理論，分析了激光與生物分子系統(tǒng)的相互作用效應(yīng)，提出分子激光遺傳誘變的孤立子——混沌機理[38]，激光對生物分子作用效應(yīng)的分形理論[39]，并對一些具體實驗結(jié)果作了理論解釋。但是，此模型完全是從物理角度出發(fā)，用經(jīng)典量子力學(xué)的方法解釋生物學(xué)現(xiàn)象，忽略了微生物細胞系統(tǒng)的復(fù)雜性，并不能完全解釋生物誘變過程。

總之，對于激光誘變微生物的機理研究，由于生物細胞內(nèi)部各系統(tǒng)的復(fù)雜性，人們研究機理時研究對象、研究方法、研究目的、研究層次的不同，導(dǎo)致了目前并沒有形成統(tǒng)一的理論解釋，每種機理都不能很好解釋誘變機理。主要是因為沒有對誘變過程中發(fā)生的微觀機理過程做深入的研究，沒有對微生物新陳代謝過程中生物化學(xué)反應(yīng)的微觀變化過程做深入的研究。由于飛秒激光脈沖寬度短、瞬時功率大、聚焦尺寸小的特點在與生物組織相互作用時所體現(xiàn)出來的優(yōu)勢，尤其是飛秒脈沖時間和生物化學(xué)反應(yīng)的時間相同，影響到了新陳代謝本質(zhì)運動，所以飛秒激光誘變機理的解釋更具有徹底性和本質(zhì)性。國內(nèi)外關(guān)于飛秒激光誘變機理的研究報道還相對較少，但是人們在飛秒誘變機理方面也取得一些進展，主要有以下幾個方面。

（1）多光子吸收機理 DNA吸收多個飛秒激光光子后，或者直接被離子化，或者發(fā)生能量堆積，產(chǎn)生電子遷移（Electron Transfer，ET）效應(yīng)后，最終導(dǎo)致DNA單鏈或者雙鏈的損傷與斷裂[14，40-42]。最近有很多文獻總結(jié)報道了多光子誘導(dǎo)堿基突變機理[43-45]，此項研究對 DNA的損傷及修復(fù)機理研究具有重要意義[46]。

（2）等離子體的形成機理 高峰值功率密度的飛秒激光光束與微生物細胞內(nèi)生物大分子作用時，處于基態(tài)的原子吸收光子后能量躍遷到高能級，形成主要由電子、離子、激發(fā)態(tài)的原子、分子和自由基等組成的低溫等離子體，等離子體效應(yīng)可使生物大分子的化學(xué)鍵發(fā)生改變[15]，導(dǎo)致突變的發(fā)生。等離子體的產(chǎn)生過程如圖2所示。等離子體的產(chǎn)生最初是通過光致電離形成的，光致電離包括隧道電離（圖2中①過程所示）和多光子電離（圖2中②過程所示），一旦介質(zhì)中產(chǎn)生一個自由電子，該電子以逆向軔致輻射的方式吸收光子，通過一系列逆向軔致輻射吸收后，電子動能大到在碰撞電離中足以產(chǎn)生另外一個自由電子（圖2中③過程所示）。這時就產(chǎn)生了兩個低動能的自由電子，它們再以逆向軔致輻射方式獲得動能，再與大的粒子（離子或原子核）碰撞，產(chǎn)生4個低動能的自由電子，以此方式循環(huán)下去，導(dǎo)致雪崩電離（圖2中④過程所示），形成等離子體。等離子體化學(xué)過程比較豐富，各種強場效應(yīng)比較顯著，通過能量沉積、動量傳遞、質(zhì)量沉積以及電荷的中和與交換等4種生物效應(yīng)導(dǎo)致細胞變異。

圖2 在等離子體形成過程中光致電離、逆軔致輻射吸收和撞擊電離的相互作用[15]

（3）生物活性氧產(chǎn)生機理 飛秒激光能激發(fā)細胞產(chǎn)生活性氧，即自由基，如過氧化氫、羥自由基和單線態(tài)氧等，而自由基的存在會導(dǎo)致DNA單鏈斷裂和堿基損傷[46]。曹恩華等[16]認為當(dāng)用激光輻照時，細胞或組織內(nèi)的內(nèi)源性色素充當(dāng)光敏劑角色，吸收光子后，使生物體膜脂質(zhì)上的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化鏈式反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧自由基。當(dāng)脂質(zhì)過氧化發(fā)生在核膜上時，自由基將優(yōu)先與DNA作用，引起DNA的損傷。

（4）DNA損傷自身修復(fù)機理 DNA損傷主要包括DNA雙鏈斷裂、堿基損傷、單鏈斷裂等類型，每種損傷類型都與細胞死亡、基因突變甚至細胞惡性轉(zhuǎn)化有密切聯(lián)系[17]。在細胞內(nèi)，DNA修復(fù)酶始終監(jiān)視染色體，一旦發(fā)現(xiàn)物理、化學(xué)、生物等因素產(chǎn)生的核苷酸殘基，就會啟動細胞自身修復(fù)機制[47]。DNA損傷修復(fù)是一種生物細胞內(nèi)的自發(fā)的代謝反應(yīng)過程，而其中 γ-H2AX（一種組蛋白）與DNA發(fā)生雙鏈斷裂修復(fù)是一個重要過程[48]。DNA發(fā)生雙鏈斷裂后最早反應(yīng)之一是位于斷裂點附近的組蛋白H2AX的C末端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化。磷酸化的γ-H2AX快速轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA損傷信號，導(dǎo)致下游分子磷酸化的激活，引發(fā)一系列的生物級聯(lián)反應(yīng)和細胞學(xué)反應(yīng)。隨著DNA損傷逐漸修復(fù)，γ-H2AX發(fā)生去磷酸化（半衰期約為2 h），直至DNA修復(fù)完成，γ-H2AX也即消失，而在DNA修復(fù)的過程中便會發(fā)生大量的突變。

高能飛秒激光光子輻射到微生物細胞上，通過多光子強烈吸收導(dǎo)致了生物分子離子化，或者發(fā)生能量堆積，造成DNA等生物大分子損傷。在這個過程中就會形成由電子、離子、激發(fā)態(tài)的原子、分子和自由基等組成的低溫等離子體，擾亂生物細胞自身的代謝過程，其中生物活性氧直接與 DNA作用，引起DNA損傷。由于細胞的修復(fù)系統(tǒng)啟動，細胞通過一系列生物化學(xué)反應(yīng)將 DNA修復(fù)，保證遺傳信息的完整性，從而將細胞自身的代謝調(diào)整到正常狀態(tài)，在這個過程中就會產(chǎn)生大量的突變。相比較于傳統(tǒng)激光的誘變機理，飛秒激光的誘變機理更具有本質(zhì)性和微觀性，結(jié)合了物理過程和生物化學(xué)反應(yīng)過程，更具有全面性和系統(tǒng)性。

3 展 望

對于飛秒輻射微生物變異的技術(shù)，目前人們還沒有進行系統(tǒng)的研究，可以結(jié)合關(guān)鍵酶活性測定和動力學(xué)參數(shù)測定，開展飛秒激光誘變微生物菌株的激光波長、能量密度、功率密度、輻射時間和輻射樣品區(qū)的光斑尺寸等激光參數(shù)對飛秒激光誘變微生物菌株效果的影響，針對菌種代謝網(wǎng)絡(luò)，選擇適當(dāng)?shù)暮Y選高產(chǎn)菌種的方法，獲得高產(chǎn)菌株。

對于飛秒誘變機理的研究，Popp等[49]和Gu等[50-51]已經(jīng)在生物光子輻射方面做了很多的工作。他們基于分子生物學(xué)中關(guān)于激基復(fù)合物（exciplex）形成的實驗結(jié)果和量子光學(xué)中的Dicke模型，建立了生物光子輻射理論，從理論上研究了光子與生物分子相作用的整個生物物理過程。故可從生物細胞DNA組、轉(zhuǎn)錄組、翻譯組、酶促反應(yīng)組等系統(tǒng)生物學(xué)角度出發(fā)，研究飛秒激光誘發(fā)生物細胞內(nèi)DNA的大分子的基態(tài)、激發(fā)態(tài)的形成，結(jié)合目前多光子吸收、形成等離子體、產(chǎn)生生物活性氧、DNA損傷自身修復(fù)等一系列的機理，重點研究光子與DNA分子相互作用的微觀生物化學(xué)過程，包括DNA損傷、DNA修復(fù)過程，最終得到飛秒激光誘變微生物可信的、統(tǒng)一的微觀量子生物物理機理模型。此機理模型的研究必將為生物突變研究工作的進一步發(fā)展提供重要的理論和實驗基礎(chǔ)。

[1] 中國遺傳學(xué)會.第八屆全國激光生物學(xué)學(xué)術(shù)會議暨《激光生物學(xué)報》創(chuàng)刊十周年慶祝會會議紀要[J].激光生物學(xué)報，2002，11（6）：465-470.

[2] 陳云琳，劉小娟，聞建平.激光誘變微生物技術(shù)的研究進展[J].生物物理學(xué)報，2003，19（4）：353-358.

[3] 盧文玉，聞建平，范晶華，等. 激光誘變玫瑰孢鏈霉菌結(jié)合鏈霉素抗性篩選法選育達托霉素高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報，2006，33（3）：114-117.

[4] Jiang Yan，Wen Jianping，Jia Xiaoqiang，et al. Mutation of Candidatropicalis by irradiation with a He-Ne laser to increase its ability to degrade phenol[J].Applied And Environmental Microbiology，2007，73（1）：226-231.

[5] 王衛(wèi)衛(wèi)，任鵬康，閻明，等.He-Ne激光對γ-亞麻酸產(chǎn)生菌少根根霉的誘變作用[J].光子學(xué)報，2002，31（2）：157-161.

[6] 張智維，王旭，劉金平.He-Ne激光誘變選育雙乙酰生成量低的啤酒酵母[J].激光技術(shù)，2005，29（5）：541-542.

[7] 李佳，劉鑫，劉克武，等.CO2激光輻射總狀毛霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶優(yōu)化條件[J].激光技術(shù)，2004，28（2）：128-130.

[8] Bouda?ffa B， Cloutier P， Hunting D，et al.Resonant formation of DNA strand breaks by low energy（3to20eV）electrons[J]. Science，2000，287：1658-1660.

[9] 顧秋亞. β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育及代謝調(diào)控的初步研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[10] Gong Jixian，Zhao Xueming，Xing Qirong，et al.Femtosecond laser-induced cell fusion[J]，Applied Physics Letters，2008，92：093901.

[11] Zewail A H.Femtochemistry past，present，and future[J].Pure Applied Chemistry，2000，72（12）：2219-2231.

[12] Halbhuber K J，K?nig K.Modern laser scanning microscopy in biology，biotechnology and medicine[J]. Annals of Anatomy，2003，185：1-20.

[13] 狄建科，周明，楊海峰，等.飛秒激光與生物細胞作用機理及應(yīng)用[J].激光生物學(xué)報，2008，17（2）：270-277.

[14] Meldrum R A，Botchway S W，Wharton C W，et al.Nanoscale spatial induction of ultraviolet photoproducts in cellular DNA by three-photon near-infrared absorption [J].EMBO Reports，2003，4（12）：1144-1149.

[15] Vogel A，Noack J，Huttmann G，et a1.Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues[J].Applied Physics B，2005，81：1015-1047.

[16] Sun Xueguang，Cao Enhua，Zhang Xiaoyan，et al.The divalent cation-induced DNA condensation studied by atomic force microscopy and spectra analysis[J]. Inorganic Chemistry Communications，2002（5）：181-186.

[17] 賓萍，鄭玉新.γ-H2AX與DNA雙鏈斷裂關(guān)系的研究進展[J].衛(wèi)生研究，2007，36（4）：520-522.

[18] 王麗，邱建榮.飛秒激光在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].激光與光電子學(xué)進展，2010，47：011701.

[19] 趙珂，王佩琳.飛秒激光在超快過程中的應(yīng)用研究[J].量子電子學(xué)報，2001，18（2）：97-102.

[20] 馬國宏，郭立俊，錢士雄.飛秒物理、飛秒化學(xué)和飛秒生物學(xué)[J].物理，2001，30（6）：349-355.

[21] Shen N，Datta D，Schaffer C B，et al.Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor[J].Mech. Chem. Biosyst.，2005，2（1）：17-25.

[22] Langford V S， McKinley A J， Quickenden T I，et al. Temperature dependence of the visible-near-infrared absorption spectrum of liquid water[J].J. Phys. Chem. A，2001，105（39）：8916-8921.

[23] Ashkin A，Dziedzic J M.Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria[J].Science，1987，235：1517-1520.

[24] 李寰宇，鞏繼賢，邢岐榮，等.飛秒激光誘導(dǎo)細胞融合技術(shù)的實驗研究[J].中國激光，2006，33（12）：1642.

[25] 鞏繼賢.飛秒激光顯微操作進行單細胞水平巔峰蝦青素生物合成研究[D].天津：天津大學(xué)化工學(xué)院，2007.

[26] Tirlapur U K，K?nig K.Targeted transfection by femtosecond laser[J].Nature，2002，418：290-291.

[27] Zeira E，Manevitch A，Khatchatouriants A， et al. Femtosecond infrared laser-an efficient and safe in vivo gene delivery system for prolonged expression[J].Molecular. Therapy.，2003，8（2）：342-350.

[28] K?nig K，Riemann I，F(xiàn)ritzsche W. Nanodissection of human chromosomes with near-infrared femtosecond laser pulses[J].Optics Letters，2001，26（11）：819-821.

[29] Wataru Watanabe，Sachihiro Matsunaga，Tomoko Shimada，et al. Femtosecond laser disruption of mito-chondria in living cells[J].Medical Laser Application，2005，20（3）：185-191.

[30] Layland K S，Riemann I，Stock U A，et al. Imaging of cardiovascular structures using near-infrared femtosecond multiphoton laser scanning microscopy[J].J. Biomed. Opt.，2005，10（2）：024017.

[31] Guehring T，Urban J P，Cui Z F，et al. Noninvasive 3D vital imaging and characterization of notochordal cells of the intervertebral disc by femtosecond near-infrared two-photon laser scanning microscopy and spatial-volume rendering[J].Microscopy Research Technique，2008，71（4）：298-304.

[32] Fiebig T，Wan C Z，Zewail A H. Femtosecond charge transfer dynamics of a modified DNA base：2-aminopurine in complexes with nucleotides[J].Chemphyschem，2002，3（9）：781-788.

[33] Binder P S，Sarayba M，Ignacio T，et al.Characterization of submicrojoule femtosecond laser corneal tissue dissection [J]. Journal of Cataract and Refractive Surgery，2008，34（1）：146-152.

[34] 陳恒雷，徐輝，呂長武，等.激光誘變育種的研究概況[J].激光生物學(xué)報，2006，15（4）：436-440.

[35] 吳光敏，周凌云.α螺旋蛋白質(zhì)螺旋鏈模型的雙孤立子效應(yīng)[J].數(shù)學(xué)物理學(xué)報，1997，17（1）：18-24.

[36] Zhou Lingyun， Zhang Canbang，Yiying Zhou，et al.Derivation of the modification heatingconduction equation of the a king of laser thermal effect by quantum mechanics[J].Chinese Optics Letters，2003，l（7）：411-413.

[37] Zhou Lingyun，Zhang Canbang，Zhou Yiying，et al.Solutions of the modification heating conduction equations of a kind of laser thermal effect[J].Chinese Optics Letters，2003，l（10）：597-600.

[38] Feng Guolin，Shao Yaochun，Sun Yaodong.Study on the stochastic Chaos in laser-DNA interactive system[J].J. Infrared Millim. Waves，2000，19（3）：169-173.

[39] 周凌云，段良和，雷玉明，等.激光對生物分子的熱作用效應(yīng)的分形理論分析[J].光電子：激光，1997，8（6）：462-465.

[40] Trautlein D，Deibler M，Leitenstorfer A，et al.Specific local induction of DNA strand breaks by infrared multi-photon absorption[J].Nucleic Acids Research，2010，38（3）：14-16.

[41] Shafirovich V， Dourandin A， Luneva N P，et al. Multiphoton near-infrared femtosecond laser pulse-induced DNA damage with and without the photosensitizer proflavine[J].Photochemistry and Photobiology，1999，69（3）：265-274.

[42] Gomez-Godinez V，Wakida N M，Dvornikov A S，et al.Recruitment of DNA damage recognition and repair pathway proteins following near-IR femtosecond laser irradiation of cells[J].JBO Letters，2007，12（2）：020505.

[43] K?nig K，Riemanna I，Strackea F，et al.Nanoprocessing with nanojoule near-infrared femtosecond laser pulses nanobearbeitung mit nanojoule nahinfrarot femtosekunden laserpulsen[J].Medical Laser Application，2005，20（3）：169-184.

[44] Grigaravicius P，Greulich K O，Monajembashi S.Laser microbeams and optical tweezers in ageing research[J]. Chem. Phys. Chem.，2009，10（1）：79-85.

[45] Dinant C，Jager J M，Essers J，et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods[J].Journal of Cell Science，2007，120：2731-2740.

[46] Botchway S W， Reynolds P，Parker A W，et al.Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies[J].Mutation Research/Reviews in Mutation Research，2010，704：38-44.

[47] 朱守民，夏昭林.DNA損傷修復(fù)基本方式的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，2003，25（5）：270-272.

[48] 王會平.組蛋白H2AX與DNA損傷的分子感應(yīng)[J].癌變，畸變，突變，2006，18（4）：334-336.

[49] Popp F A，Li K H，Gu Q.Recent Advances in Biophoton Research and its Applications[M].USA，Singapore：World Scientific，1992：113-152.

[50] Gu Q，Popp F A.Nonlinear response of biophoton emission to external perturbations[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1992，48（11-12）：1069-1082.

[51] Popp F A，Gu Q，Li K H.Biophoton emission：Experimental background and theoretical approaches [J].Modern Physics Letters B，1994，8（21-22）：1269-1296.

Research progress of technology and mechanism of femtosecond laser induced micro-organisms mutation

LI Haiwei1，CHEN Yunlin1，HUANG Di2，WEN Jianping2
（1College of Science，Beijing Jiaotong University，Beijing 100044，China；
2School of Chemical Engineering & Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Q 631

A

1000–6613（2011）04–0824–07

；2010-09-25；修改稿日期；2010-10-25。

國家自然科學(xué)基金資助項目（21076022）。

李海偉（1985—），男，碩士研究生。E-mail 09122190@ bjtu.edu.cn。聯(lián)系人：陳云琳，女，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail ylchen@bjtu.edu.cn。