劉燦均,蔡圣強(qiáng),車彥軍

(江蘇省靖江市人民醫(yī)院外科,江蘇靖江,214500)

胃癌是最常見的癌腫之一,占我國(guó)消化道腫瘤的第一位。近年來(lái)的研究表明,Wnt-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的不恰當(dāng)激活參與多種人類腫瘤的發(fā)病而蛋白激活酶受體-1(Proteinase-Activated Receptor-1 PAR-1)基因可能是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因[1-2]。因此Wnt-1和PAR-1在胃癌中的基因表達(dá)以及與胃癌的病理特征3者間是否有相關(guān)性,目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)尚無(wú)報(bào)道。本研究采用免疫組化的方法檢測(cè)胃癌及正常胃組織中Wnt-1和PAR-1的基因表達(dá),研討2者在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性,以及與胃癌病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2008年1月～2010年12月的胃癌根治術(shù)切除病例的、經(jīng)10%甲醛固定的石蠟包埋的胃癌組織標(biāo)本78例,其中男51例,女27例;年齡39～83歲,平均58.3歲。所有納入研究對(duì)象的病例均接受胃癌根治術(shù),術(shù)前均未行放、化療和生物免疫治療。根據(jù)入選病例的性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期等病理特點(diǎn)進(jìn)行分組,其中年齡分為<60歲組和≥60歲組,按腫瘤大小分為腫瘤直徑<5 cm組和腫瘤直徑≥5 cm組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況按目的蛋白表達(dá)陽(yáng)性與否分為2組,其余病理特征均按等級(jí)進(jìn)行分組。同時(shí)對(duì)其中50例患者的癌旁正常胃組織作為正常對(duì)照。

1.2 試劑

Wnt-1山羊抗人多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;PAR-1兔抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcom公司;一抗工作液濃度均為1:100。二抗的山羊SP試劑盒和兔SP試劑盒均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色

將入選病例的手術(shù)標(biāo)本和正常對(duì)照標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后,4 μ m后的切片貼于載玻片上,經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,PBS洗3次,3 min/次;熱修復(fù)抗原后室溫冷卻,PBS洗5 min后,在過(guò)氧化氫甲醇溶液中浸泡30 min,以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;然后PBS洗3次,3min/次;滴加正常的山羊血清封閉液室溫下20 min,甩去多余液體,滴加一抗4℃過(guò)夜。37℃下復(fù)溫45 min,PBS洗3次,3 min/次,加生物素化二抗,室溫下30 min;DAB顯色,自來(lái)水洗滌后核蘇木素復(fù)染,脫水,透明樹膠封片。以PBS替代一抗行陰性對(duì)照。陽(yáng)性片一抗體說(shuō)明書自帶的陽(yáng)性結(jié)果作為參照。

1.4 結(jié)果判定

Wnt-1異常表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中;PAR-1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。采用二級(jí)計(jì)分法來(lái)評(píng)估免疫組化的染色效果,首先按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;然后按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分:細(xì)胞內(nèi)無(wú)陽(yáng)性染色者或陽(yáng)性細(xì)胞率<10%者為0分,陽(yáng)性細(xì)胞率10%～25%者為1分,陽(yáng)性細(xì)胞率25%～50%者為2分,陽(yáng)性細(xì)胞率50%～75%者為3分,陽(yáng)性細(xì)胞率>75%者為4分。將每張片子的的隨機(jī)的5個(gè)視野中2者評(píng)分結(jié)果相加的平均值得到的即為免疫組化評(píng)分。陽(yáng)性結(jié)果判斷:≤3分者為陰性(-),>3分者為陽(yáng)性(+)。

2 結(jié) 果

2.1 Wnt-1和PAR-1在胃癌原發(fā)灶和正常為組織的表達(dá)

Wnt-1異常表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中;PAR-1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上,2者在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常胃組織(P<0.05),有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

表1 Wnt-1和PAR-1在胃癌原發(fā)灶和正常為組織的表達(dá)

2.2 Wnt-1和PAR-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

分別將Wnt-1和PAR-1表達(dá)陽(yáng)性與否分為2組:即目的蛋白表達(dá)陽(yáng)性組和目的蛋白表達(dá)陰性組,觀察每組病例的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為 N0、N1、N2、N3。采用 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果顯示:Wnt-1表達(dá)陽(yáng)性組和Wnt-1蛋白表達(dá)陰性組相比較,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從數(shù)據(jù)中可以看出,Wnt-1表達(dá)陽(yáng)性組具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率;同樣的,PAR-1表達(dá)陽(yáng)性組和PAR-1蛋白表達(dá)陰性組相比較,PAR-1表達(dá)陽(yáng)性組具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P<0.01),見表2。

表2 Wnt-1和PAR-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3 Wnt-1和PAR-1的表達(dá)與病理特征的關(guān)系

本研究中,將患者分別按性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期等病理特點(diǎn)進(jìn)行分組,根據(jù)免疫組化染色情況分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn),結(jié)果顯示:Wnt-1和PAR-1的表達(dá)與患者的性別和年齡無(wú)關(guān),與腫瘤的大小、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期密切相關(guān)(P<0.05),見表3。從表中數(shù)據(jù)可以看出,腫瘤越大、腫瘤分化程度越低、浸潤(rùn)深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高以及TNM分期越晚Wnt-1和PAR-1的表達(dá)率也越高。

表3 Wnt-1和PAR-1的表達(dá)與病理特征的關(guān)系

2.4 Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達(dá)的相關(guān)性研究

為了更好地分析Wnt-1和PAR-1二者在胃癌中表達(dá)的相關(guān)性,本研究經(jīng)免疫組化染色評(píng)分結(jié)果分為4個(gè)等級(jí),即0～1分、2～3分、4～5分和6～7分,各等級(jí)中Wnt-1和PAR-1的表達(dá)情況即構(gòu)成比見表4;各構(gòu)成比采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果顯示呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。

表4 Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

Wnt基因于1982年發(fā)現(xiàn),與小鼠乳腺癌,最初被命名為NT-1,后發(fā)現(xiàn)與果蠅的無(wú)翅基因wingless(wg)高度同源,因此被命名為Wnt基因。Wnt蛋白是一種由Wnt基因編碼的分泌糖蛋白,分泌后與細(xì)胞表面基質(zhì)及其特異性受體卷曲蛋白(Fz)相互作用,通過(guò)其下游散亂蛋白(DSH)、GSK23β 、β2catenin 、APC 等磷酸化和去磷酸化過(guò)程來(lái)完成Wnt信號(hào)傳遞,組成Wnt途徑。Wnt通路是一種對(duì)細(xì)胞增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),是一個(gè)由多種分子參與、相互影響、相互制約的復(fù)雜體系。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)很多腫瘤發(fā)生與Wnt信號(hào)異常相關(guān),在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也不乏Wnt信號(hào)通路異常的報(bào)道[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)Wnt-1在胃癌組織中有表達(dá),在正常胃黏膜組織中無(wú)表達(dá),與正常組織相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Wnt-1與癌組織的分化高低有關(guān),高分化組織中表達(dá)低于低分化組織,與Jnsson等[4]在乳腺癌組織中研究的結(jié)果高分化者表達(dá)高,低分化者表達(dá)較少相反。Jnsson等對(duì)乳腺癌進(jìn)行的相關(guān)研究表明,Wnt表達(dá)丟失可能是一個(gè)獨(dú)立于淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤大小的,有用的預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的標(biāo)志物,Wnt的丟失增加乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的早期復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險(xiǎn),他們提出,Wnt蛋白在乳腺發(fā)揮腫瘤抑制作用。目前認(rèn)為不同腫瘤中Wnt的作用機(jī)制可能存在差異[5]。本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)Wnt-1在胃癌組織中表達(dá)水平與腫瘤大小、侵入深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)。這與Khor等[3]結(jié)直腸癌的研究相似。這也與國(guó)外學(xué)者Katoh[6]檢測(cè)結(jié)果基本一致,Katoh在對(duì)人類癌細(xì)胞中Wnt-1的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn):在GCOKAJIMA細(xì)胞系和胰腺癌BxPC-3細(xì)胞系中Wnt-1 mRNA的表達(dá)量明顯升高,在原發(fā)型胃癌患者中Wnt-1mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率占50%。因此認(rèn)為Wnt-1可以作為評(píng)價(jià)胃癌生物學(xué)行為較好的指標(biāo),同時(shí)也為抗癌藥物的研究提供了新靶點(diǎn)。

蛋白酶激活受體(PAR)又稱凝血酶受體,PAR-1是PARs家族的主要成員,是最早發(fā)現(xiàn)的PARs分子,人PAR-1基因定位于染色體5q13,含有 2個(gè)外顯子,由425個(gè)氨基酸組成,蛋白核心分子量為47 000,具有典型的G蛋白耦聯(lián)膜受體結(jié)構(gòu)特征,它介導(dǎo)凝血酶的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)[7]。研究表明,PAR-1參與多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等復(fù)雜生物學(xué)行為,PAR-1表達(dá)水平可能與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移特性相關(guān)[2],與前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān),在黑色素瘤也是隨惡性度增加而陽(yáng)性表達(dá)提高,最近研究顯示,PAR-1表達(dá)水平也與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性密切相關(guān)[8]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)PAR-1在腫瘤中表達(dá)的研究報(bào)道還見于肺癌、宮頸癌、鼻咽癌,可見PAR-1與惡性上皮性腫瘤的惡性侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

本研究結(jié)果示PAR-1的表達(dá)在胃癌組織中高于癌旁胃組織,有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且PAR-1的表達(dá)水平與腫瘤大小、侵入深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)。由此可見,PAR-1在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中起著重要作用,其詳細(xì)作用機(jī)制遠(yuǎn)未被闡明,需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)室研究。本研究結(jié)果表明,Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達(dá)成正相關(guān),但具體的作用機(jī)制尚不清楚,我們推測(cè),PAR-1在胃癌中的表達(dá)是否與通過(guò)激活Wnt信號(hào)途徑而發(fā)揮作用有關(guān)尚待進(jìn)一步研究探索。就本研究的臨床資料和病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果可明確,PAR-1與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。

[1]Clevers H.Wnt/beta-catenin signaling in development and disease[J].Cell,2006,127:469.

[2]Beaulieu L M,Church F C.Activated protein C promotes breast cancer cell migration through interactions with EPCR and PAR1[J].Exp Cell Res,2007,313(4):677.

[3]Khor T O,Gul Y A,Ithnin H,et al.A comparative study of the expression of Wnt-1,WISP-1 survivin and cyclin-D1 in colorectal carcinomas[J].Int J Colorectal Dis,2006,21(4):291.

[4]J nsson M,Dejmek J,Bendahl P O,et al.Loss of Wnt-5a protein is associated with early relapse in invasive ductal breast carcinomas[J].Cancer Res,2002,62:409.

[5]O′Connell M P,Weeraratna A T.Hear the Wnt Ror:how melanoma cells adjust to changes in Wnt[J].Pigment Cell Melanoma Res,2009,22:724.

[6]Katoh M.Expression and regulation of WNT-1 in human cancer:up-regulation of WNT-1 by beta-estradiol in MCF-7 cells[J].Int J Oncol,2003,22(1):209.

[7]Tsopanoglou N E,Maragoudakis M E.Role of t hrombin in angio-genesis and tumor progression[J].Semin Thromb Hemost,2004,30:63.

[8]Fujimoto D,Hirono Y,Goi T,et al.The activation of Proteinase-Activated Receptor-1(PAR-1)mediates gastric cancer cell proliferation and invasion[J].BMC Cancer,2010,10:443.