蘇 沐,張全安

(江蘇省南京市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,江蘇南京,210003)

1994年,Lapidot等[1]首次提出腫瘤干細胞的概念。2003年,Al-Hajj分離鑒定出具有類似干細胞生物學特性的細胞群,首次在實體瘤中證明了腫瘤干細胞的存在。同年,Singh分離出一群細胞生物學特征和神經(jīng)干細胞相似的細胞。從那以后,不斷地有研究人員從肺癌、大腸癌、肝癌、腎癌及卵巢癌等腫瘤中分離獲得腫瘤干細胞。本研究選取原代人結(jié)腸癌細胞為研究對象,通過對新鮮的結(jié)腸癌腫瘤組織進行原代培養(yǎng),采用無血清懸浮法篩選人結(jié)腸癌干細胞樣亞群,并做初步研究,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

無血清培養(yǎng)基(SFM)為不含牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,并添加堿性成纖維生長因子bFGF、重組表皮生長因子EGF、白血病抑制因子LIF、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 mmol/L煙酰胺、5 mmol/L HEPES、1×105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素。含血清培養(yǎng)基(SSM)為含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,并添加L-谷氨酰胺2 ml/L,青霉素G 1×105U/L和鏈霉素100 mg/L。

1.2 方法

原代結(jié)腸癌細胞的培養(yǎng):SFM法培養(yǎng)分離獲得的結(jié)腸癌細胞,當細胞生長到80%融合時,傳代。培養(yǎng)的前4代細胞在傳代時每次都保留部分細胞凍存于液氮中。

四甲基偶氮唑藍(MTT)法計算抑制率:將經(jīng)SFM 培養(yǎng)獲得的結(jié)腸癌細胞5×104/mL于96孔板的培養(yǎng)箱中孵育24h后,加入濃度分別為3.125 mg/L 、6.25 mg/L 、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L及100 mg/L的5-氟尿嘧啶(5-Fu),每個濃度設(shè)5個平行孔。另設(shè)陰性對照組和空白調(diào)零孔。孵育24～48 h后,加入MTT孵育4 h,自動酶標儀上測定OD 570值。抑制率=(1-實驗組平均OD570值/對照組平均OD 570值)×100%。

流式細胞術(shù)(FCM)檢測側(cè)群(SP)細胞比例:每組細胞分置于A、B2管中,800r/min離心5 min;2管均加入5 μ g/mL的Hoechst 33342及無血清培養(yǎng)基;僅在 B管內(nèi)加入50 μ mol/L的維拉帕米,水浴 37℃90 min。后置于4℃直至FCM檢測SP細胞比例。

FCM檢測細胞表面分子CD133的表達和RT-PCR半定量檢測干細胞標記物Musashi-1:將細胞800 r/min離心5 min,分別加入20 μ LCD133單克隆抗體(4℃,30 min),冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,于FCM 檢測CD133+細胞比例;按TaKaRa試劑盒提供的說明書進行RT-PCR操作。Musashi-1引物下游序列為5′-GGAAACTGGTAGGTGTAG-3′,上游序列為 5′-GGCTTCGTCACTTACATGGACCAGGCG-3′。

細胞免疫化學顯示Musashi-1表達:PBS洗滌玻片3次;甲醇/醋酸固定10 min;甲酰胺100℃5 min變性核酸;H2O2,37℃10 min;“A”液(封閉血清),室溫10～15 min;加入 Musashi-1單克隆抗體,4℃,過夜;“B”液(生物素化二抗)置室溫孵育30 min;滴加“C”液(S-P液),37 ℃下15 min;滴加Western顯色(DAB)液;蒸餾水沖洗,蘇木素復染30 s,水洗、干燥、封片。

克隆形成試驗測定克隆形成率:制成5細胞/mL、10個細胞/mL密度的細胞懸液。取各密度的細胞懸液200 μ L接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。鏡下計數(shù)含50個細胞以上的克隆,并計算形成率。

2 結(jié) 果

2.1 原代結(jié)腸癌細胞的無血清培養(yǎng)及球樣細胞團的形成

在SFM中,原代培養(yǎng)獲得的結(jié)腸癌細胞經(jīng)24～48 h后,大部分不貼壁,形成少量松散、懸浮生長、體積較小的細胞球(細胞數(shù)在8～10個左右)。1～2周細胞球體積增大,一部分細胞團崩解凋亡,細胞球形狀較規(guī)則,球內(nèi)折光性較好,細胞數(shù)增多,細胞間連接致密。培養(yǎng)2周時,難以區(qū)分細胞間的分界。接種于含SSM的原代結(jié)腸癌細胞,絕大部分貼壁生長,未見懸浮細胞球的產(chǎn)生,且生長較SFM組迅速。

表1 5-Fu對人結(jié)腸癌細胞的增殖能力( ±s,n=5)

表1 5-Fu對人結(jié)腸癌細胞的增殖能力( ±s,n=5)

與SSM 組比較,＊＊P<0.01。

5-Fu(mg/L)生長抑制率(%)SFM組 SSM組3.125 10.26±0.01＊＊ 18.63±0.04 6.25 21.77±0.01＊＊ 44.28±0.03 12.5 27.85±0.03＊＊ 53.26±0.03 25 43.23±0.04＊＊ 67.15±0.02 50 63.52±0.04＊＊ 70.21±0.02 100 70.64±0.02＊＊ 80.33±0.03

2.2 不同培養(yǎng)條件下,5-Fu對人結(jié)腸癌細胞生長抑制的影響

各濃度 5-Fu(3.125、6.25、12.5 、25 、50、100 mg/L)作用于結(jié)腸癌細胞48 h后的生長抑制率,見表1。5-Fu對SFM組和SSM組人結(jié)腸癌細胞的生長抑制作用均呈劑量依賴性;5-Fu對SFM組結(jié)腸癌細胞的抑制率明顯低于SSM組的結(jié)腸癌細胞,2組間存在顯著性差異(P<0.01)。

2.3 不同培養(yǎng)條件及5-Fu干預對SP細胞比例的影響

不同培養(yǎng)條件下人結(jié)腸癌細胞中的SP細胞比:SFM組SP細胞比例(5.13±1.78)%。SSM組SP細胞比例(0.56±0.46)%。經(jīng)5-Fu干預后,SFM組中SP細胞比例變化為(9.3 6±0.59)%;SSM組中SP細胞比例變化為(3.28±0.78)%。

2.4 不同培養(yǎng)條件下及5-Fu干預后人結(jié)腸癌細胞CD133的表達

5-Fu干預前,SFM組CD133表達的細胞比例明顯高于SSM組(P<0.01);經(jīng)5-Fu干預后,SFM組中CD133+細胞仍明顯多于SSM組(P<0.01)。同時,SFM組及SSM組中CD133+細胞比例在5-Fu干預后均有提高(P<0.01)。見表2。

表2 不同培養(yǎng)條件下及5-Fu干預后人結(jié)腸癌細胞CD133+細胞比例( ±s,n=5)

表2 不同培養(yǎng)條件下及5-Fu干預后人結(jié)腸癌細胞CD133+細胞比例( ±s,n=5)

與5-Fu干預前SSM組比較,＊＊P<0.01;與5-Fu干預后SSM組比較,##P<0.01;與5-Fu干預前SFM 比較,P<0.01。

組別 CD133+細胞比例(%)SFM 組 5-Fu干預前 6.71±0.03＊＊5-Fu干預后 12.84±0.16##SSM組 5-Fu干預前 2.05±0.15 5-Fu干預后 5.46±0.06＊＊

2.5 不同培養(yǎng)條件及5-Fu干預對Musashi-1表達的影響

2.5.1 Musashi-1 mRNA表達的不同:與SSM比較,SFM條件下,人結(jié)腸癌細胞中Musashi-1 mRNA的表達增加(P<0.05);5-Fu的干預可使得SSM組及SFM組Musashi-1 mRNA的表達均有進一步增加(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)條件及5-Fu干預對Musashi-1 mRNA表達的影響

2.5.2 Musashi-1在細胞中表達的不同:Musashi-1的表達于細胞質(zhì)中。結(jié)論與 RTPCR所示Musashi-1 mRNA表達變化是一致的。見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)條件及5-Fu干預對Musashi-1表達影響的細胞免疫組化

2.6 培養(yǎng)條件及5-Fu干預對人結(jié)腸癌細胞克隆形成能力的影響

5-Fu干預前和經(jīng)5-Fu干預后,SFM組的克隆形成能力分別明顯強于SSM組(P<0.01)。SFM組和SSM組的克隆形成能力在5-Fu干預后有所提高(P<0.01)。見表3。

表3 不同培養(yǎng)基及5-Fu干預后的人結(jié)腸癌細胞的克隆形成率( ±s)

表3 不同培養(yǎng)基及5-Fu干預后的人結(jié)腸癌細胞的克隆形成率( ±s)

與5-Fu干預前SSM組比較,＊＊P<0.01;與5-Fu干預后SSM組比較,##P<0.01;與5-Fu干預前SFM 比較,P<0.01。

組別 克隆形成率/%(n=10)SFM 組 5-Fu干預前 7.21±0.02＊＊5-Fu干預后 15.85±0.14##SSM組 5-Fu干預前 1.53±0.25 5-Fu干預后 6.42±0.15＊＊

3 討 論

細胞系是經(jīng)歷體外培養(yǎng)獲得“永生性”的細胞,在其不斷的傳代過程中,性質(zhì)已經(jīng)發(fā)生一定的變化[2];且細胞系這種“永生性”與腫瘤干細胞的特征有異曲同工之處。原代培養(yǎng)細胞離體時間短,性狀與體內(nèi)更接近,基因突變率較細胞系低,更適于研究。這也是本研究再選擇原代人結(jié)腸癌細胞進一步研究的原因所在。目前分離腫瘤干細胞的方法主要有以下3種:根據(jù)細胞表面標記物利用流式細胞儀進行分選、分離獲得SP細胞[3-4]及無血清培養(yǎng)腫瘤球形成。

長期干細胞研究中發(fā)現(xiàn),含細胞生長因子的無血清培養(yǎng)基可利于正常干細胞體外擴增,同時可維持干細胞的未分化狀態(tài)及多向分化潛能。有人將正常腦組織中的神經(jīng)干細胞在含bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞在含生長因子的無血清培養(yǎng)基中可擴增數(shù)量并維持神經(jīng)干細胞多向分化潛能。將神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]、結(jié)腸癌[6-7]制成的單細胞懸液置于含 EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)基中,少數(shù)未分化的腫瘤細胞可形成懸浮細胞球,稱為“腫瘤干細胞球”[8]。

本研究即采用含生長因子的無血清培養(yǎng)基(SFM)培養(yǎng)原代人結(jié)腸癌細胞,形成細胞球,諸多的研究將此稱為腫瘤干細胞球,其中富含腫瘤干細胞。與SSM相比,SFM組中SP細胞比例及CD133+細胞比例較高、Musashi-1的表達較強,且克隆形成能力較強。而 SP細胞、CD133及Musashi-1的表達以及克隆形成能力的檢測是目前被廣泛用于鑒定結(jié)腸癌干細胞功能特征的方法。因此,本研究有理由認為含生長因子的培養(yǎng)基可以成功地富集腫瘤干細胞樣細胞群,為進一步研究結(jié)腸癌腫瘤干細胞的生物學特征奠定基礎(chǔ)。此外,5-Fu對SFM組細胞的抑制率較低,該結(jié)果與腫瘤干細胞理論中所提及的腫瘤干細胞可能是化療耐藥的根源所在是一致的[9]。本研究比較了5-Fu干預前后結(jié)腸癌細胞中SP細胞比例、CD133及Musashi-1表達及克隆形成能力的改變。結(jié)果顯示,經(jīng)5-Fu干預后,無論SSM組還是SFM組,SP細胞比例增加、CD133+細胞數(shù)增多、Musashi-1 mRNA的表達增強,SFM 組的克隆形成能力增強。該結(jié)果從側(cè)面提示5-Fu可進一步富集結(jié)腸癌干細胞,純化經(jīng)SFM培養(yǎng)獲得結(jié)腸癌腫瘤干細胞樣細胞群,使其腫瘤干細胞的特征更突出,有利于進一步研究結(jié)腸癌干細胞。

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