王艷宏，王秋紅，夏永剛，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實驗室、黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥藥性理論是中藥理論體系的核心，也是中藥學(xué)的特色。如何做到既能闡明中藥性味理論的科學(xué)內(nèi)涵，又能保持和發(fā)揚(yáng)中醫(yī)藥自身的特色優(yōu)勢，一直是中醫(yī)藥學(xué)者面臨的艱巨任務(wù)和巨大挑戰(zhàn)。遵循中醫(yī)藥學(xué)基本理論，本課題組提出了“中藥一味一性，一藥X味Y性(Y≤X)”的假說和基于中藥性味可拆分性和可組合性的研究思路，并構(gòu)建了中藥性味理論研究的新模式［1－2］。

麻黃為草麻黃(Ephedra sinica Stapf)、中麻黃(Ephedra Intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木賊麻黃(Ephedra equisetina Bge.)的干燥草質(zhì)莖，辛、微苦，溫。具有發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫的功效［3］。為了闡明麻黃辛味和苦味的物質(zhì)基礎(chǔ)，我們采用與麻黃性味功效相關(guān)的解熱、發(fā)汗、利尿、平喘、免疫抑制等復(fù)合藥理學(xué)指標(biāo)作為麻黃性味藥理學(xué)評價系統(tǒng)，對麻黃的各化學(xué)拆分組分的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了研究。文章報道了麻黃化學(xué)拆分組分的制備方法及其對干酵母致熱作用的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，體質(zhì)量(180～220)g，合格證號為P00102004，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評價中心提供。

1.2 儀器

2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);冷凍干燥機(jī)GLZY－0.5B(上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司);OMRON電子體溫計MC－670(歐姆龍有限公司)。

1.3 藥品及試劑

麻黃藥材購自山西大同藥材公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定為麻黃科植物草麻黃(Ephedra sinica Stapf)的干燥草質(zhì)莖，符合《中國藥典》2010年版有關(guān)規(guī)定。732型陽離子交換樹脂、717型陰離子交換樹脂(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所);AB－8型大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司);安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。

2 方法

2.1 麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)的拆分研究

2.1.1 麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)的拆分方法

采用水蒸氣蒸餾法，獲得揮發(fā)油組分。多糖組分的拆分:蒸餾后的水溶液濃縮至0.5g/mL(以生藥量計)，通過AB－8大孔吸附樹脂柱色譜(上樣量為1g麻黃:5mL濕樹脂)，依次用5BV水、30%乙醇、95%乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液。95%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，獲得95%乙醇洗脫部分。水洗脫液，減壓濃縮至0.5g/mL(以生藥量計)，加95%乙醇，使含醇量達(dá)80%，靜置24h，離心，用80%乙醇多次洗滌沉淀至洗滌液三氯化鋁、三氯化鐵紙片反應(yīng)均呈陰性，沉淀冷凍干燥后，即得多糖組分。將醇沉上清液與30%乙醇洗脫液合并，減壓回收至無醇味，加水調(diào)節(jié)至5×10－3g/mL(以生藥量計)，用濃鹽酸調(diào)至pH值=2，通過732型陽離子交換樹脂，隨行采用茚三酮、改良碘化鉍鉀試液TLC法檢測流出液。交換完全后，樹脂水洗至中性，取出，空氣干燥。將干燥的樹脂用氨水，乙醚進(jìn)行連續(xù)回流提取，至提取液茚三酮紙片反應(yīng)陰性，減壓回收溶劑至干，即得生物堿組分。將732型陽離子交換樹脂的流出液，通過AB－8大孔吸附樹脂柱色譜(上樣量為1g麻黃:5mL濕樹脂)，依次用5BV水、30%乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液。水洗脫部分，繼續(xù)通過陰離子交換樹脂，流出液及30%乙醇洗脫液分別減壓回收溶劑，冷凍干燥后與上述獲得95%乙醇洗脫部分合并，即得酚酸組分。

2.1.2 麻黃各化學(xué)拆分組分的指紋圖譜測定

為評價麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)的拆分方法的合理性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，本文對生物堿組分和酚酸組分別進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究。

2.1.2.1 生物堿組分HPLC指紋圖譜的建立 色譜條件:Waters公司2695型高效液相色譜儀，2996型檢測器，Empower工作站;色譜柱為Diamonsil(TM)鉆石C18(5μm，250mm ×4.6mm);流速為 1.0mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為210nm;流動相的梯度洗脫表見Tab.1。

2.1.2.2 酚酸組分HPLC指紋圖譜的建立 色譜條件:Waters公司2695型高效液相色譜儀，2996型檢測器，Empower工作站;色譜柱為 PAK C18色譜柱(4.6mmI.D ×250mm);流速為 1.0mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為270nm;流動相的梯度洗脫表見Tab.2。

Tab.1 Gradient elution table of alkaloid

Tab.2 Gradient elution table of phenolic acid

2.1.3 麻黃化學(xué)拆分組分的化學(xué)成分互不交叉性研究

由于揮發(fā)油組分和多糖組分與其他化學(xué)拆分組分化學(xué)成分交叉的可能性較小，所以，分別采用生物堿組分和酚酸組分的TLC法、HPLC法分析條件，對麻黃各化學(xué)拆分組分化學(xué)成分的互不交叉性進(jìn)行了研究。

TLC法:1)以硅膠G薄層，三氯甲烷－甲醇(5∶1)上行展開，茚三酮、硫酸乙醇、三氯化鋁、三氯化鐵溶液顯色。2)以聚酰胺薄膜，甲醇－水(4∶1)上行展開，以三氯化鋁、三氯化鐵顯色。

HPLC 法:色譜條件同 2.1.2。

2.2 麻黃各化學(xué)拆分組分對干酵母致熱作用的影響

取體質(zhì)量180～220g的雄性Wistar大鼠70只，于實驗前置于實驗室(環(huán)境溫度26℃，相對濕度60%)適應(yīng)環(huán)境，并每日測定其肛內(nèi)溫度2～3次。按體質(zhì)量及基礎(chǔ)體溫隨機(jī)分為7組，分別為水煎液組、揮發(fā)油組、生物堿組、多糖組、酚酸組、模型對照組、空白對照組。

大鼠于實驗前8～10h開始禁食但不禁水，實驗當(dāng)日每小時測體溫1次，連續(xù)2～3次，取平均值為正常體溫。選取體溫變化不超過0.3℃的動物供實驗用。除空白對照組外，模型對照組和各藥物組大鼠每只從背部皮下注射20%安琪高活性干酵母混懸液5.0mL/kg。給致熱劑5h后，各組均灌胃給藥，水煎液給藥劑量按人和大鼠3倍等效劑量折算給予實驗動物，各化學(xué)拆分組分按其在生藥中含量同等劑量給予實驗動物，給藥體積為1.0mL/100g，模型對照組和空白對照組灌胃給予等體積蒸餾水。然后于給藥后1h、2h、4h、6h測量肛溫。試驗結(jié)果以實測值表示。

3 結(jié)果

3.1 麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)的拆分研究

取麻黃1kg，按照麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)拆分的工藝拆，獲得揮發(fā)油組分0.5mL、生物堿組分10.0g、多糖組分58.9g、酚酸組分47.0g。

所建立的生物堿組分的HPLC指紋圖譜，相似度在0.99以上，精密度、穩(wěn)定性良好;共確定8個共有峰，主要為麻黃堿、甲基麻黃堿等生物堿類化合物。

所建立的酚酸組分的HPLC指紋圖譜，相似度在0.98以上，精密度、穩(wěn)定性良好;共確定13個共有峰，主要為黃酮類化合物和鞣質(zhì)等酚酸類化合物。

TLC法檢識結(jié)果:以茚三酮、碘化鉍鉀顯色，生物堿組分分別顯紫色和橘黃色斑點(diǎn)，其余各化學(xué)拆分組分均不顯色;以三氯化鋁顯色，在紫外燈下檢識，酚酸組分為黃色熒光斑點(diǎn)，以三氯化鐵顯色，酚酸組分為所顯斑點(diǎn)為綠黑色，其余各化學(xué)拆分組分均不顯色。

HPLC法分析結(jié)果:以生物堿組分的HPLC指紋圖譜條件分析，多糖和酚酸組分無與生物堿組分相應(yīng)的色譜峰;以酚酸組分的HPLC指紋圖譜條件分析，生物堿和多糖組分無與酚酸組分相應(yīng)的色譜峰。

3.2 麻黃化學(xué)拆分組分對干酵母致熱作用的影響實驗結(jié)果見Tab.3。

Tab.3Effects of Ephedra and its components separated by drug property on the fever by yeast(±s，n=10)

Tab.3Effects of Ephedra and its components separated by drug property on the fever by yeast(±s，n=10)

注:Compared with the model group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

body temperature change(℃)normal After yeast After drug(min)1h 2h 4h 6h Control 1ml 37.44 ±0.67 37.43 ±0.43＊＊ 37.5 ±0.39＊＊ 37.58 ±0.38＊＊ 37.3 ±0.44＊＊ 37.51 ±0.54 Group Dosagemg(100g)＊＊Model 1ml 37.30 ±0.63 39.26 ±0.49 39.72 ±0.38 39.76 ±0.38 39.87 ±0.33 39.64 ±0.51 Water－decocted 270 37.37 ±0.63 39.16 ±0.40 39.43 ±0.49 39.80 ±0.37 39.88 ±0.39 39.20 ±0.45*Alkaloid 2.7 37.17 ±0.64 39.15 ±0.44 39.50 ±0.53 39.90 ±0.45 39.99 ±0.38 39.08 ±0.61*Volatile oil 1.35 ×10 －4ml 37.27 ±0.67 39.16 ±0.47 39.55 ±0.51 39.65 ±0.31 40.08 ±0.38 39.26 ±0.30*polysaccharide 15.9 37.31 ±0.66 39.21 ±0.49 39.54 ±0.22 39.64 ±0.28 39.67 ±0.26 39.50 ±0.35 phenolic acid 12.7 37.34 ±0.66 39.38 ±0.60 39.73 ±0.32 39.80 ±0.36 39.84 ±0.23 39.22 ±0.43*

由Tab.1中數(shù)據(jù)可知，模型對照組和各藥物組皮下注射酵母混懸液5h后，體溫升高均在0.8℃以上，而空白對照組體溫幾乎沒有變化，表明酵母混懸液已制備出實驗性大鼠發(fā)熱模型。在試驗觀察的給藥后6h內(nèi)，模型對照組的體溫升高持續(xù)存在，與空白對照組比較差異非常顯著(P＜0.01)，進(jìn)一步說明酵母制備出的實驗性大鼠發(fā)熱模型穩(wěn)定可靠。各實驗組給藥后6h，水煎液組、生物堿組、揮發(fā)油組及酚酸組與模型對照組比較有解熱作用(P＜0.05)，多糖組解熱作用不明顯(P＞0.05)。

4 討論

4.1 麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)拆分方法的建立

由于對中藥有效成分的研究存在著大量遺漏，即使是被認(rèn)為無效的成分，多數(shù)也不能確定其是否真正無效;另外，很多化學(xué)成分的藥理作用非常顯著，在其它組分中即使有微量的殘留，也會有顯著的藥理作用，從而導(dǎo)致各拆分組分的性味歸屬出現(xiàn)偏差;同時，某些化學(xué)成分的穩(wěn)定性和活性會受到酸堿等外界條件的影響，所以麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)拆分方法建立的原則為開展全成分拆分，且各拆分組分之間成分應(yīng)盡量無交叉和保持原型狀態(tài)。

根據(jù)文獻(xiàn)報道及預(yù)試驗結(jié)果得知，麻黃中化學(xué)成分構(gòu)成主要為揮發(fā)油、生物堿、鞣質(zhì)、黃酮、多糖等成分，考慮中醫(yī)臨床用藥主要為水煎液的傳統(tǒng)，故采用雙提法、醇沉法、大孔吸附樹脂和離子交換樹脂等方法和技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實現(xiàn)性味物質(zhì)基礎(chǔ)的拆分，通過應(yīng)用雙提法可以獲得揮發(fā)油組分和水提液，將水提液醇沉后可以獲得多糖組分，上清液回收乙醇后，采用離子交換樹脂技術(shù)獲得生物堿組分，進(jìn)而使用大孔吸附樹脂獲得酚酸組分。

為進(jìn)一步給本文所建立的麻黃性味物質(zhì)基礎(chǔ)拆分方法提供科學(xué)依據(jù)，課題組首先建立了生物堿和酚酸組分的HPLC指紋圖譜，以評價拆分方法的合理性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性;進(jìn)而又分別采用TLC、HPLC法進(jìn)行了各化學(xué)拆分組分化學(xué)成分的互不交叉確證試驗。結(jié)果表明，該拆分方法為全成分拆分，各組分成分之間互不交叉，且盡量保持了化學(xué)成分的原型;其中生物堿組分主要為麻黃堿等生物堿;酚酸組分主要為黃酮和鞣質(zhì)類化合物;揮發(fā)油組分主要為萜類和芳香族化合物;醇沉組分主要為多糖等成分［4］。本文研究工作中建立的拆分方法，具有科學(xué)性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可以為開展同類研究提供借鑒。

4.2 麻黃的解熱作用評價

歷代本草關(guān)于麻黃具有解熱作用的記載，《本經(jīng)》:“溫瘧，發(fā)表出汗，去邪熱氣”;《藥性論》:“主壯熱，解肌發(fā)表”;《日華子本草》:“退熱，御山嵐瘴氣”;《湯液本草》:“散表寒，發(fā)浮熱也”;《本草崇原》:“溫瘧發(fā)表出汗，去邪熱氣者，謂溫瘧病藏于腎，麻黃能起水氣而周遍于皮毛，故主發(fā)表出汗，而去溫瘧邪熱之氣也”;《本草經(jīng)解》:“溫瘧，但熱不寒之瘧也，溫瘧而頭痛，則陽邪在上，必發(fā)表出汗，乃可去溫瘧邪熱之氣，所以亦可主以麻黃也”。通過這些論述可以得知麻黃具有解熱作用，且可能源于其具有發(fā)汗作用，也可能由于其具有“御山嵐瘴氣”的作用。現(xiàn)代對麻黃開展解熱作用研究的報道較少。本結(jié)果表明，麻黃具有一定的解熱作用，但發(fā)揮作用較緩慢，且作用微弱。

4.3 麻黃發(fā)揮解熱作用的物質(zhì)基礎(chǔ)為生物堿組分、揮發(fā)油組分及酚酸組分

關(guān)于麻黃生物堿、非麻黃堿組分的解熱作用，文獻(xiàn)報道較少。關(guān)于麻黃揮發(fā)油的解熱作用則有文獻(xiàn)報道，如麻黃揮發(fā)油乳劑對人工發(fā)熱的兔具有解熱作用，麻黃揮發(fā)油及萜松醇對正常小鼠體溫有降溫作用，以萜松醇作用更為明顯。本研究結(jié)果表明，麻黃生物堿、揮發(fā)油、非生物堿組分均具有解熱作用，是其發(fā)揮解熱作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。多糖組分無解熱作用，應(yīng)該與生物堿組分等分屬于不同性味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］ 匡海學(xué)，程偉.中藥性味的可拆分、可組合性研究［J］.世界科學(xué)技術(shù) －中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11(6):768－771.

［2］ 匡海學(xué)，王艷宏，王秋紅，等.基于中藥性味可拆分性和可組合性的中藥性味理論研究新模式［J］.世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12(6):1 －5.

［3］ 楊繼榮，王艷宏，關(guān)楓.麻黃本草考證概覽［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(2):51－52.

［4］ 夏永剛，梁軍，楊炳友，等.麻黃多糖中糖醛酸含量的測定［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(1):71 －73.