石華月 張青 李慧 儲(chǔ)婷 金輝 毛聲俊

肺癌在我國(guó)已占據(jù)惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率的第1位,調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì).盡管近20年來肺癌的治療有了很大的進(jìn)展,但肺癌患者的預(yù)后卻無明顯提高,5年生存率僅10%-15%,而其它腫瘤的平均5年生存率能達(dá)到62%-97%[1,2].肺癌的流行及其嚴(yán)重危害已使其治療藥物成為臨床不可缺少且地位極其重要的一大類藥物.因此,尋找新的抗癌藥物對(duì)肺癌的治療具有重大意義.

丹參為唇形科鼠尾草屬植物(Salvia miltiorrhiza bunge)的干燥根部,具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩等功效,入藥歷史悠久.丹參酮(Tanshinone, Tan)作為丹參根部的乙醚或乙醇提取物,是丹參的主要有效部位.按其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮I等15種成分(圖1).近年來大量研究[3-6]證實(shí),丹參酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性,是一種有前途的抗癌藥物.本研究以人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1為研究對(duì)象,考察丹參酮類化合物(丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I)對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用,并比較四者對(duì)SPC-A-1細(xì)胞株的藥效學(xué)差異,為探討丹參酮類化合物細(xì)胞毒性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系以及開發(fā)用于治療肺癌的丹參酮制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

圖 1 丹參酮類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu).A:丹參酮類化合物基本結(jié)構(gòu);B:二氫丹參酮I;C:丹參酮I;D:丹參酮IIA;E:隱丹參酮.Fig 1 Chemical structures of Tanshinones. A: basic structure of Tanshinones; B: Dihydrotanshinone I; C: Tanshinone I; D: TanshinoneIIA; E:Cryptotanshinone.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品 RPMI-1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清為鄭州伯安生物工程有限公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為BIOSHARP公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)分析純?yōu)樘旖蚴胁┑匣び邢薰井a(chǎn)品;十二烷基硫酸鈉(SDS)分析純?yōu)閺V東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品;亞砷酸注射液(H3AsO3)為哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,實(shí)驗(yàn)前用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成2 μg/mL的藥液;丹參酮IIA為西安天豐生物科技有限公司產(chǎn)品,由本實(shí)驗(yàn)室精制,純度達(dá)99.2%(HPLC);丹參酮I、二氫丹參酮I、隱丹參酮均為成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品;丹參酮類化合物均用DMSO溶解(DMSO終濃度為0.03%,一般認(rèn)為DMSO≤0.1%時(shí),不引起細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)改變),配制成1.7 mg/mL的儲(chǔ)備液,過濾除菌,于4oC條件下避光保存?zhèn)溆?

1.1.2 細(xì)胞株 人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞株由生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,用含10%滅活標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,于37oC、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2-3天傳代1次.實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞.

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞,消化制成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù),調(diào)整其密度為2X104個(gè)/mL,接種于96孔板中,每孔100 μL;接種細(xì)胞后,于37oC、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后給藥.以等體積的亞砷酸(2 μg/mL)作為參比藥物組,不加藥的細(xì)胞組作為空白對(duì)照組,RPMI-1640培養(yǎng)液組作為空白組用以調(diào)零.給藥組分別加入不同濃度的丹參酮IIA、丹參酮I、二氫丹參酮I和隱丹參酮,給藥濃度分別為2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0 μg/mL,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每孔20 μL.分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,加入5 mg/mL MTT液(每孔20 μL),于37oC、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng).4 h后按照文獻(xiàn)[7]中的方法,加入由異丁醇、濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)配制的甲瓚裂解液(100 μL/孔),于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜至甲瓚全部溶解,微孔板恒溫震蕩儀震蕩10 min,使完全混勻.酶標(biāo)儀570 nm(參比波長(zhǎng)630 nm)處測(cè)各孔光密度(optical density, OD)值,以該復(fù)孔的平均值作為該組細(xì)胞的OD值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍,結(jié)果取其平均值,并按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率.細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為:

抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/空白對(duì)照組平均OD值)X100%.

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)情況 在加藥實(shí)驗(yàn)過程中,分別于24 h、48 h和72 h觀察丹參酮化合物組(4.0 μg/mL)、參比藥物組(2 μg/mL)以及空白對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況.

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示,組間比較采用One way ANOVA檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 丹參酮類化合物對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的增殖抑制作用SPC-A-1細(xì)胞經(jīng)4種藥物處理后,與空白對(duì)照組相比,其OD值均有不同程度的下降,且隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),OD值下降趨勢(shì)明顯(表1-表4).其中,二氫丹參酮I組、丹參酮I組中細(xì)胞的OD值下降較明顯,2.0 μg/mL處理24 h后,其OD值與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;二氫丹參酮I組、丹參酮I組和丹參酮IIA在2.0 μg/mL處理24 h后表現(xiàn)出增殖抑制作用.隱丹參酮組起效較慢,6.0 μg/mL作用24 h才表現(xiàn)出增殖抑制作用,且2.0 μg/mL隱丹參酮分別作用48 h和72 h時(shí)抑制作用均不明顯,OD值與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.與參比藥物組相比,4種藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用均與亞砷酸作用趨勢(shì)一致,且4.0 μg/mL二氫丹參酮I、4.0 μg/mL丹參酮I、8.0 μg/mL丹參酮IIA、10.0 μg/mL隱丹參酮作用72 h后的抑制率(分別為83.40%、72.57%、62.37%、69.96%)與2 μg/mL亞砷酸作用72 h(65.22%)的抑制率相當(dāng)或更高.4種藥物(二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮)作用24 h后IC50值分別為2.77 μg/mL、6.01 μg/mL、>10.00 μg/mL和>10.00 μg/mL;作用48 h的IC50值分別為1.80 μg/mL、4.04 μg/mL、8.12 μg/mL、8.71 μg/mL;作用72 h的IC50值分別為1.36 μg/mL、1.69 μg/mL、3.81 μg/mL、7.35 μg/mL,可見4種藥物中二氫丹參酮I起效濃度最低,其次為丹參酮I、丹參酮IIA和隱丹參酮,且其抑制率均呈明顯的時(shí)間正相關(guān)性(表5).

2.2 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài) SPC-A-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,空白對(duì)照組可見貼壁生長(zhǎng)、細(xì)胞清晰,胞質(zhì)飽滿,核膜、核仁輪廓明顯,相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片(圖2A);2 μg/mL亞砷酸組(圖2B)可見視野中大部分細(xì)胞失去貼壁特性,細(xì)胞逐漸由貼壁而脫落,細(xì)胞皺縮、體積變小、變形,呈現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用與細(xì)胞凋亡特征;二氫丹參酮I組(圖2C)和丹參酮I組(圖2D)中的細(xì)胞形態(tài)與亞砷酸組相似,多數(shù)細(xì)胞由貼壁而脫落,出現(xiàn)細(xì)胞變小、皺縮和變形現(xiàn)象,且與空白對(duì)照組相比視野中細(xì)胞數(shù)明顯減少;丹參酮IIA組(圖2E)和隱丹參酮組(圖2F)中,可見部分細(xì)胞由貼壁而脫落,呈現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變小和變形的狀態(tài),與空白對(duì)照組相比視野中細(xì)胞數(shù)明顯減少,但較二氫丹參酮I組(圖2C)和丹參酮I組(圖2D)視野中細(xì)胞數(shù)較多.該結(jié)果表明,四種丹參酮類化合物均能抑制SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)其凋亡,其中二氫丹參酮I作用強(qiáng)度最強(qiáng),丹參酮I和丹參酮IIA次之,隱丹參酮的作用強(qiáng)度則相對(duì)較弱,與MTT檢測(cè)的結(jié)果一致.

表 1 不同濃度二氫丹參酮I在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Mean±SD)Tab 1 Growth inhibition effect of Dihydrotanshinone I over a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times(Mean±SD)

3 討論

丹參酮是中藥丹參的主要脂溶性成分,目前已有大量報(bào)道其在體外能對(duì)抗多種腫瘤細(xì)胞,作用機(jī)制主要涉及抑制腫瘤細(xì)胞增殖[8]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與分化、抑制細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[9]等方面.2008年,Lee[10]觀察研究了二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA及隱丹參酮對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用與GSH/GSSG(還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)比例變化之間的關(guān)系,結(jié)果表明二氫丹參酮I及丹參酮I誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用與GSH/GSSG比例變化呈明顯的正相關(guān)性,而丹參酮IIA及隱丹參酮?jiǎng)t無此相關(guān)性;Wayne[11]用此4種丹參酮化合物處理p53基因表型不同的3株肝癌細(xì)胞系以及Pgp過表達(dá)的R-HepG2細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮I及丹參酮I對(duì)4種肝癌細(xì)胞均有較好的增殖抑制作用,而隱丹參酮和丹參酮IIA則對(duì)Pgp過表達(dá)的R-HepG2更有效,其中隱丹參酮能有效抑制Pgp介導(dǎo)的藥物外排,丹參酮IIA與阿霉素聯(lián)用則表現(xiàn)出最強(qiáng)的藥物協(xié)同作用.這些研究結(jié)果表明不同的丹參酮化合物的抗腫瘤活性存在分子機(jī)制上的差異,提示這可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同有關(guān).

表 2 不同濃度丹參酮I在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Mean±SD)Tab 2 Growth inhibition effect of TanshinoneⅠover a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times (Mean±SD)

表 3 不同濃度丹參酮IIA在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Mean±SD)Tab 3 Growth inhibition effect of Tanshinone IIA over a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times (Mean±SD)

表 4 不同濃度隱丹參酮在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Mean±SD)Tab 4 Growth inhibition effect of Cryptotanshinone over a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times (Mean±SD)

表 5 丹參酮類化合物對(duì)SPC-A-1的IC50值(24 h、48 h和72 h)Tab 5 IC50 of Tanshinones on SPC-A-1 cells at 24 h, 48 h and 72 h

圖 2 SPC-A-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h的倒置顯微鏡圖.A:未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞;B:2.0 μg/mL亞砷酸組;C:4.0 μg/mL二氫丹參酮I組;D:4.0 μg/mL丹參酮I組;E:4.0 μg/mL丹參酮ⅡA組;F:4.0 μg/mL隱丹參酮組.Fig 2 Cell morphology observed by inverted phase contrast microscope after incubated for 48 h. A: no treatment; B: treated with 2 μg/mL arsenious acid; C: treated with 4.0 μg/mL dihydrotanshinone I; D:treated with 4.0μg/mL tanshinone I; E: treated with 4.0 μg/mL tanshinone IIA; F: treated with 4.0 μg/mL cryptotanshinone.

本研究以人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1作為細(xì)胞模型,研究比較了丹參酮類4種化合物(丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I)的細(xì)胞毒性作用,結(jié)果表明4種化合物均能有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng),且抑制作用呈明顯的時(shí)間、濃度依賴性.通過比較4種化合物作用24 h、48 h、72 h后的IC50值可發(fā)現(xiàn),4種化合物的細(xì)胞增殖抑制作用強(qiáng)度依次為二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮,此結(jié)果與葉因濤等[12]在宮頸癌HeLa細(xì)胞研究方面實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本一致,而在肺癌研究領(lǐng)域還無相關(guān)報(bào)道,本研究對(duì)于開發(fā)用于治療肺癌的丹參酮制劑有重要意義.丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮及二氫丹參酮I均為丹參二萜醌類化合物,其結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在A環(huán)與C環(huán)的不同(圖1).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,A環(huán)為芳環(huán)的化合物(二氫丹參酮I和丹參酮I)的細(xì)胞毒性明顯強(qiáng)于A環(huán)為脂環(huán)的化合物(丹參酮IIA和隱丹參酮),其原因可能是當(dāng)A環(huán)為芳環(huán)時(shí),可影響整個(gè)分子的三維圖像,表現(xiàn)為使B、C兩個(gè)環(huán)平面之間的兩面夾角減小,從而增強(qiáng)化合物細(xì)胞毒性[13].對(duì)于呋喃環(huán)和醌類產(chǎn)生細(xì)胞毒性的作用機(jī)制,長(zhǎng)期以來的觀點(diǎn)是其能產(chǎn)生自由基而引起DNA損傷.2008年,Zhang[14,15]否認(rèn)了這一假設(shè),其研究結(jié)果顯示丹參酮IIA的呋喃氧并不產(chǎn)生自由基,而是通過與DNA雙螺旋中腺嘌呤上的N形成氫鍵,改變DNA構(gòu)型,導(dǎo)致RNAPII磷酸化并降解,激活p53基因,從而產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用;并進(jìn)一步認(rèn)為,當(dāng)C環(huán)為二氫呋喃環(huán)時(shí),由于氧原子上的孤對(duì)電子不參與共軛,其電負(fù)性更強(qiáng),更易形成氫鍵,因此細(xì)胞毒性應(yīng)強(qiáng)于C環(huán)為呋喃環(huán)的化合物.這一結(jié)論雖可用于解釋二氫丹參酮I的細(xì)胞毒性強(qiáng)于丹參酮I,但卻與丹參酮IIA細(xì)胞毒性強(qiáng)于隱丹參酮這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖,說明這其中還存在有其它的因素,如呋喃氧發(fā)揮細(xì)胞毒性作用是否僅為與DNA小溝結(jié)合,A環(huán)為脂環(huán)時(shí)對(duì)呋喃氧及二氫呋喃氧的成鍵是否存在影響等.因此,對(duì)于丹參酮類化合物的細(xì)胞毒性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系有待更深入的研究與探討,方能更全面地闡釋其細(xì)胞毒性的分子機(jī)理,為對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和修飾,進(jìn)而研制開發(fā)有效的創(chuàng)新抗癌藥物提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).