柴文戍，李 穎

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

銅綠假單胞菌(PA)是種植于支氣管擴(kuò)張、肺囊性纖維化和慢性阻塞性肺病患者下呼吸道的機(jī)會(huì)致病菌，可持續(xù)刺激宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)展性氣道破壞，廣泛存在于土壤、水及各種動(dòng)物體內(nèi)，具有多重耐藥的特點(diǎn)［1］，一旦感染，臨床治療十分困難。肺巨噬細(xì)胞是肺組織細(xì)胞免疫的首道屏障，在肺部特異及非特異免疫系統(tǒng)中起重要作用。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，PA 能誘導(dǎo)人類 U937 細(xì)胞發(fā)生凋亡［2，3］。隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐步認(rèn)識(shí)到細(xì)胞周期不僅與細(xì)胞增殖直接相關(guān)，而且與細(xì)胞分化和凋亡有關(guān)［4］。然而，PA誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡是否與細(xì)胞周期有關(guān)目前尚不清楚。2009年8月～2010年10月，我們通過流式單染技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期，探討PA感染宿主的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 PA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心惠贈(zèng)，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。J774巨噬細(xì)胞來源于鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。培養(yǎng)基采用含10%FBS和100 U/ml慶大霉素的高糖型DMEM。Annexin V凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌上清液的制備 在8 ml大豆肉湯培養(yǎng)基中通過振蕩培養(yǎng)法(37℃，8 h)對PA進(jìn)行增菌，5000 r/min 離心15 min 后，用孔徑0.22 μm 的濾膜過濾，獲得細(xì)菌上清液，最后滅火(56℃、1 h)，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌感染細(xì)胞 將貼壁的J774細(xì)胞常規(guī)胰蛋白酶消化傳代，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液1次。生長基本融合的貼壁J774細(xì)胞棄培養(yǎng)基，加入2 ml含胎牛血清、不含抗生素的DMEM懸浮細(xì)菌液，使J774細(xì)胞與PA上清液以15%的濃度混合，37℃水浴中培養(yǎng)3、6、9 h后分別行J774細(xì)胞凋亡檢測。同時(shí)將實(shí)驗(yàn)分為:①正常對照組(不含PA);②PA感染3 h組;③PA感染6 h組;④PA感染9 h組。

1.2.3 凋亡細(xì)胞檢測 ①吉姆薩染色:與PA上清液共培養(yǎng)3、6、9 h后的J774細(xì)胞用PBS沖洗2遍，然后用甲醇室溫固定5～7 min，干燥后用吉姆薩染液染色15 min，三蒸水沖洗3遍，空氣中晾干，將蓋玻片用純甘油固定在載玻片上，用普通顯微鏡觀察。②Annexin V/PI單染分析進(jìn)行細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期檢測:取PA上清液作用0、3、6、9 h的細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后，用70%的冷乙醇固定，采用PI一步插入性DNA定量熒光染色法檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 吉姆薩染色結(jié)果顯示，感染3 h組細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，感染6 h組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。感染9 h組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓，可見凋亡小體。隨著感染細(xì)胞時(shí)間的延長，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞逐漸增多，對照組則不受影響。

2.2 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期檢測結(jié)果比較 PA上清液對J774細(xì)胞有明顯的抑制生長的作用，流式細(xì)胞圖可見典型的亞二倍體凋亡峰，細(xì)胞周期分布顯示，9 h內(nèi)S期細(xì)胞隨時(shí)間延長而減少，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，凋亡率也增加。各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.01);各實(shí)驗(yàn)組間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.01)。見表1。

3 討論

目前，研究細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的關(guān)系已成為熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以吉姆薩染色及流式單染技術(shù)研究了PA上清液對J774細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)PA上清液能誘導(dǎo) J774細(xì)胞發(fā)生凋亡，與國外研究一致［5］。通過吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，感染3 h組細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，感染6 h組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。感染9 h組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓，可見凋亡小體。且隨著J774細(xì)胞感染時(shí)間延長，凋亡的J774細(xì)胞增多。根據(jù)流式單染技術(shù)證實(shí)，S期細(xì)胞隨時(shí)間延長而減少，G0/G1期細(xì)胞漸增多，凋亡率也增加。提示PA以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)人J774細(xì)胞凋亡，同時(shí)說明PA誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期有關(guān)。

表1 PA上清液對J774細(xì)胞周期分布和凋亡的影響(n=5，%，)

表1 PA上清液對J774細(xì)胞周期分布和凋亡的影響(n=5，%，)

注:與0 h比較，*P ＜0.01;與3 h比較，#P ＜0.01;與6 h比較，★P ＜0.01

檢測指標(biāo)0 h 3 h 6 h 9 h細(xì)胞周期G0/G1 57.90 ±1.0062.90 ±0.79* 68.34 ±0.87*# 72.54 ±0.50*#★S 30.82 ±0.6826.49 ±0.63* 20.19 ±0.84*# 11.70 ±0.62*#★G2/M 11.26 ±1.0010.62 ±1.41 11.47 ±0.73 15.76 ±0.27*#★凋亡率 2.78 ±0.3512.44 ±0.56* 30.82 ±0.83*# 41.79 ±1.03*#★

細(xì)胞周期是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，每個(gè)分期互相聯(lián)系，不可分割。按DNA合成、分裂過程分為合成前、合成期、合成后期和分裂期，即G0/G1、S、G2和M 期，M期細(xì)胞一分為二。影響細(xì)胞周期的外界因素如生物、理化因素及缺氧、營養(yǎng)不良等，都可導(dǎo)致細(xì)胞周期的各種改變?nèi)鏕1期阻滯、S期蓄積、G2期阻滯和M期延緩等［6］，造成細(xì)胞增殖發(fā)生障礙。細(xì)胞周期的改變既是受損的結(jié)果，也是自我保護(hù)的表現(xiàn)，周期暫時(shí)停止進(jìn)程，會(huì)避免錯(cuò)誤即受損的DNA復(fù)制、分裂，直至缺陷得以糾正，細(xì)胞才會(huì)順利進(jìn)入下一時(shí)相［7］。較小的DNA損傷引起細(xì)胞周期停滯，而較嚴(yán)重的DNA損傷使得細(xì)胞凋亡。一些關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，提示細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡存在一個(gè)協(xié)調(diào)的機(jī)制。有研究證明，飽和脂肪酸棕櫚酸可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，且作用呈時(shí)間與劑量依賴性。其機(jī)制為使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例。提示飽和脂肪酸棕櫚酸抑制細(xì)胞的增殖是通過G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，影響其復(fù)制。

流式細(xì)胞儀可通過觀察整個(gè)細(xì)胞周期DNA含量的變化來分析細(xì)胞的凋亡。整個(gè)復(fù)制周期可以描述為G0/G1、S、G2/M。本研究通過流式單染技術(shù)，證明PA上清液能誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡，且與細(xì)胞周期有關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞調(diào)控中，G1～S期調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞、整合匯集到細(xì)胞核對細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)［8］。

綜上所述，PA上清液能誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡，且與細(xì)胞周期有關(guān)。因此，尋找調(diào)節(jié)G1～S期調(diào)控點(diǎn)的藥物，對臨床抑制PA感染具有良好的前景。

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