章丹丹， 高月紅， Jessica Tao Li， 潘一峰， 卞 卡，3*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203;2.上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司，上海 200051;3.美國(guó)德克薩斯大學(xué)休斯頓醫(yī)學(xué)院綜合生物及藥理學(xué)系，德克薩斯大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所，休斯頓TX 77030)

桑枝Mori Ramulus是?？浦参锷orus albaL.的干燥嫩枝，是中醫(yī)常用的傳統(tǒng)藥物，有祛風(fēng)活絡(luò)、通利關(guān)節(jié)、燥濕利水之功效，臨床多用于肩臂關(guān)節(jié)腫痛麻木，風(fēng)濕痹證等多種疾?。?］。桑枝含有多種黃酮成分，具有抗炎抗氧化、降糖降脂以及提高機(jī)體免疫功能等多種藥效［2］。桑枝作為保健物品，其皮的醇提物具有較好的2，2-diphenyl-picrylhydrazyl radical(DPPH)自由基清除作用，不同桑枝品種總黃酮的總抗氧化能力、清除自由基能力及清除超氧陰離子能力各有不同，且總抗氧化能力與總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系［3］。目前尚無(wú)應(yīng)用多種化學(xué)和細(xì)胞模型對(duì)桑枝精制總黃酮進(jìn)行綜合抗氧化活性研究的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)考察了利用有機(jī)溶劑及大孔樹(shù)脂純化富集的桑枝總黃酮于體外3種抗氧化無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)和2種細(xì)胞炎癥模型中的抗氧化活性。

1 材料和儀器

1.1 藥材和試劑 桑枝購(gòu)自上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司。D-101樹(shù)脂，天津南開(kāi)大學(xué)化工廠。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心。小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7購(gòu)自ATCC公司。RPMI 1640、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。Trolox、DPPH、2，4，6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ)、2，2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)、肌紅蛋白(Mb)、血管緊張素(Ang II)、二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖(lipopolysaccharide LPS)、Griess reactin試劑均購(gòu)自Sigma公司。Bio-rad蛋白測(cè)定試劑購(gòu)自Bio-rad公司。鼠重組IFN-γ購(gòu)自BD公司。其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司);D278532高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);超低溫冰箱(美國(guó) Thermo公司);UV21700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 桑枝總黃酮(TFMR)的制備 桑枝飲片用75%乙醇80℃回流提取3次，合并提取液，過(guò)濾后減壓回收乙醇。得到的乙醇提取物用石油醚脫脂，直至石油醚層近無(wú)色。脫脂提取物加水溶解，離心后取上清液，用乙酸乙酯萃取多次至乙酸乙酯層無(wú)色，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮至小體積，D-101樹(shù)脂柱吸附，繼而以蒸餾水、10%乙醇預(yù)洗脫，70%乙醇洗脫樹(shù)脂柱，收集70%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮物真空干燥得桑枝總黃酮。

2.2 桑枝總黃酮的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取21.5 mg蘆丁置于100 mL量瓶中，用95%乙醇溶解，再用30%乙醇定容至刻度。準(zhǔn)確吸取此標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 置25 mL 量瓶，分別加30%乙醇至 10 mL，搖勻，加 5%NaNO21.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al2(NO3)31.0 mL，搖勻，放置6 min，再加1 mol/L NaOH 10 mL，用30%乙醇定容后搖勻，放置15 min，以0管作為空白，于510 nm處測(cè)吸收值A(chǔ)，以濃度C對(duì)吸光值A(chǔ)回歸，A=2.435 1C－0.002 8，R2=0.998 7。將桑枝總黃酮樣品稀釋一定濃度，精密吸取1 mL于25 mL量瓶，平行3管，分別加30%乙醇至10 mL，以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)吸光值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算桑枝樣品液的總黃酮量為59.28%。

2.3 桑枝總黃酮的直接抗氧化能力測(cè)定

2.3.1 Ferric reduction ability power(FRAP)法245 μL新鮮配制的FRAP溶液，加入5 μL樣品，靜置10 min后，593 nm測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照Trolox對(duì)還原Fe3+的能力。FRAP溶液:0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ(溶于 40 mmol/L HCl)和20 mmol/L FeCl3以10∶1∶1(v/v)混合。結(jié)果用mmol/L Trolox相對(duì)值表示。

2.3.2 DPPH 法 245 μL 0.1 mmol/L DPPH 甲醇溶液中加入5 μL樣品，室溫靜止放置30 min，于517 nm處測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照Trolox對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果用mmol/L Trolox相對(duì)值表示。

2.3.3 2，2-azinobis-［3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic］acid(ABTS)法 385 μL PBS(5 mmol/L，pH 7.4)，加入 50 μL Mb(45 μmol/L)和10 μL 樣品，再加55 μL ABTS(1.8 mmol/L)，精確3 min 后，在734 nm測(cè)量樣品及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照對(duì)ABTS的清除能力。結(jié)果用mmol/L Trolox相對(duì)值表示。

2.4 桑枝總黃酮干預(yù)細(xì)胞炎癥模型

2.4.1 Griess法考察桑枝總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥模型亞硝酸鹽含量的影響 RAW264.7細(xì)胞株培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃和CO25%條件下培養(yǎng)。細(xì)胞懸液以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。桑枝總黃酮以0.1 g/L終濃度預(yù)孵育6 h。空白組采用含0.1%DMSO的RMPI 1640培養(yǎng)細(xì)胞。模型組采用 LPS(100 μg/L)和 IFN-γ(1 ×104U/L)協(xié)同刺激細(xì)胞。刺激維持24 h后，吸取96孔板中的培養(yǎng)液100 μL，加入等體積的Griess試劑，室溫反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀讀取540 nm處光吸收值。以亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑枝總黃酮干預(yù)后細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽的含量及其抑制率。

2.4.2 ABTS和FRAP法考察桑枝總黃酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型中抗氧化活性的影響 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于5%CO237℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。終濃度0.1 g/L的桑枝總黃酮和人血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)預(yù)孵育1 h后加入終濃度為 0.02 μmol/L Ang II，作用 24 h 后，收集細(xì)胞蛋白，Lowry法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)水平后取蛋白上清液，應(yīng)用ABTS和FRAP法進(jìn)行抗氧化檢測(cè)，細(xì)胞結(jié)果以mmol/L Trolox當(dāng)量/g蛋白表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 桑枝總黃酮的直接抗氧化能力 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桑枝總黃酮清除ABTS自由基的能力為0.623個(gè)Trolox當(dāng)量(1 mmol/L Trolox的清除自由基能力)，DPPH自由基的能力為0.245個(gè)Trolox當(dāng)量，而對(duì)鐵離子的還原能力為0.181個(gè)Trolox當(dāng)量。其中，桑枝總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力＞對(duì)DPPH自由基的清除能力＞對(duì)鐵離子的還原能力(見(jiàn)表1)。

表1 桑枝總黃酮的抗氧化能力(mmol/L Trolox當(dāng)量，n=3)Tab.1 Antioxidants activities of TFMR(m mol/L Trolox equivalent，n=3)

3.2 桑枝總黃酮干預(yù)對(duì)LPS協(xié)同IFN-γ刺激細(xì)胞模型中亞硝酸鹽量的影響 桑枝總黃酮干預(yù)LPS協(xié)同IFN-γ刺激細(xì)胞模型后，模型組亞硝酸鹽量顯著增高，較對(duì)照組提高了12.948倍(P＜0.01)，給藥組與模型組相比，亞硝酸鹽量下降了31.405%(P＜0.05)，抑制率達(dá)51.890%(見(jiàn)表2)。

表2 桑枝總黃酮對(duì)亞硝酸鹽量的影響(n=6)Tab.2 Nitrite accumulation of TFMR by LPS plus IFN-γ stimulated cell inflammatory model(n=6)

3.3 桑枝總黃酮干預(yù)Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型 Ang II刺激細(xì)胞后，模型組總抗氧化能力和還原能力均下降(P＜0.05)，桑枝總黃酮干預(yù)細(xì)胞后，無(wú)論采用FRAP法還是ABTS法，細(xì)胞蛋白的總抗氧化水平均顯著高于模型組(P＜0.05)(見(jiàn)表3)。

4 討論

自由基生物學(xué)研究認(rèn)為眾多疾病如心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等與過(guò)量的自由基如活性氧/活性氮(ROS/RNS)引起的氧化應(yīng)激，對(duì)DNA、蛋白質(zhì)及生物膜產(chǎn)生損傷密切有關(guān)。炎癥是以上疾病共有的病理機(jī)制，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在著氧化應(yīng)激［4］。Ang II能引起血管壁的炎癥反應(yīng)，用血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEIs)和Ang II拮抗劑等對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)進(jìn)行阻斷，可減少血管炎性細(xì)胞。LPS協(xié)同IFN-γ是經(jīng)典的炎癥刺激物，對(duì)巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)炎癥模型已廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病的分子病理機(jī)制的研究。

表3 桑枝總黃酮在Ang II模型中的抗氧化能力(mmol/L Trolox當(dāng)量/g蛋白，n=3)Tab.3 Antioxidant capacity of TFMR by AngII stimulated cell inflammatory model(mol/L Trolox/g protein，n=3)

自由基的清除是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制［5］。ABTS法和DPPH法都是檢測(cè)樣品對(duì)自由基的清除能力，當(dāng)ABTS由過(guò)硫酸銨氧化產(chǎn)生ABTS·+自由基，它與ferryl-肌紅蛋白在734 nm處形成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色發(fā)色基團(tuán)，當(dāng)有抗氧化劑和氫供體存在時(shí)，抑制發(fā)色基團(tuán)形成，抑制程度取決于樣品的抗氧化活性和濃度［6］。DPPH法利用了抗氧化劑清除DPPH·時(shí)與其孤對(duì)電子配對(duì)而使其在517 nm處的吸光值降低的原理［7］。而FRAP法基于氧化還原反應(yīng)的比色法，在酸性條件下三價(jià)鐵被抗氧化劑還原成二價(jià)鐵在593 nm處有強(qiáng)吸收，從而檢測(cè)抗氧化劑的還原能力［8］。Griess法是利用檢測(cè)試劑與自由基一氧化氮的穩(wěn)定產(chǎn)物亞硝酸鹽形成的紫紅色物質(zhì)在540 nm處有強(qiáng)吸收來(lái)檢測(cè)樣本對(duì)亞硝酸鹽的清除能力［9］。Trolox是一種類似于VE的水溶性物質(zhì)，常常作為自由基反應(yīng)的參比物，評(píng)價(jià)被測(cè)樣品的總抗氧化能力及被測(cè)樣品間的橫向比較。

本實(shí)驗(yàn)采用了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體外化學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法綜合評(píng)價(jià)桑枝總黃酮的抗氧化活性。桑枝總黃酮顯示較強(qiáng)的自由基清除能力，且對(duì)ABTS自由基的清除能力優(yōu)于DPPH自由基的清除能力，具有良好的還原能力。在細(xì)胞炎癥模型中對(duì)ABTS自由基的清除能力優(yōu)于對(duì)鐵離子的還原能力，并能清除亞硝酸鹽。對(duì)桑枝總黃酮的抗氧化能力檢測(cè)提示其作用機(jī)制側(cè)重于清除自由基能力。

桑枝總黃酮作為天然抗氧化劑提高細(xì)胞清除自由基能力，在抗氧化、對(duì)抗衰老及防癌方面具有一定的作用，作為抗氧化藥物具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

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