賁永光， 鐘紅茂， 李 康， 孔繁晟， 李文燕， 楊鼎隆

(1.廣東藥學院 藥科學院，廣東廣州 510006;2.中國科學院南海海洋研究所，廣東廣州 510301)

螺旋藻多糖是從螺旋藻藻體、螺旋藻培養(yǎng)液中提取分離出來的一類具有促進細胞生長、提高免疫力作用、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、對核酸內(nèi)切酶活性和DNA修復合成有增強作用等功能的重要天然生物活性物質(zhì)，是國內(nèi)外海洋藥物研究開發(fā)的熱點。螺旋藻多糖的主要成分有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖等，它們僅占細胞成分的2% ～3%，但卻有著獨特的生理功能和藥用價值。螺旋藻多糖是由O-鼠李糖-甲基鼠李糖和O-己糖醛酸2種雙糖重復組成，這種從螺旋藻中分離、純化的水溶性多糖，可調(diào)節(jié)人體生理功能，促進細胞新陳代謝，增強機體免疫力。將在預防醫(yī)學、臨床醫(yī)學、保健食品等方面發(fā)揮重大作用［1-5］。

本研究探討利用超聲提取技術(shù)手段對螺旋藻多糖進行提取研究，并與常規(guī)提取法進行比較。

1 材料

1.1 材料 螺旋藻購自市場(經(jīng)中國科學院南海海洋研究所鑒定)，經(jīng)曬干后進行粉碎至40目備用。葡萄糖對照品(分析純，純度≥99%，廣州汕頭市西隴化工廠)。

1.2 試劑 無水乙醇、95%乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸，以上試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設備 HH-6恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠);RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠);予華牌循環(huán)水真空泵(河南省鞏義市英峪予華儀器廠);UV1101紫外/可見分光光度儀(上海天美科學儀器有限公司);AY120電子分析天平(日本島津公司);KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);搖擺式高速中藥粉碎機(大德中藥機械有限公司)。

2 試驗方法

2.1 葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖50.0 mg，置100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻。制成標準溶液(0.5 mg/mL)。

2.2 標準曲線制備 精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置50 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密吸取上述各種質(zhì)量濃度溶液2.0mL，另精密吸取蒸餾水2.0 mL作空白對照，置具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸 5.0 mL 搖勻，于沸水浴中加熱15 min，冷卻，于490 nm波長測定吸收度值。結(jié)果見圖。以吸收值A(chǔ)為縱坐標，質(zhì)量濃度C為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程A=26 541C+0.011 3，r=0.997 7(n=6)。結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.000 002 5～0.000 025 g/mL范圍內(nèi)與吸收值線性關(guān)系良好。

2.3 螺旋藻多糖的制備及定量測定 準確稱取螺旋藻干粉5.00 g→放入圓底燒瓶，加入適量蒸餾水并混勻→按各種設定條件(時間、功率、固液比、溫度)在超聲波儀器內(nèi)進行提取→離心、沉淀(3 000 r/min，10 min)→提取清液→濃縮至1/5→5倍95%乙醇沉淀→丙酮洗滌，加適量蒸餾水溶解，置100 mL量瓶中，稀釋至刻度，精密吸取2 mL置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密吸取溶液2.0 mL，另精密吸取蒸餾水2.0 mL作空白對照，置具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL 搖勻，于沸水浴中加熱 15 min，冷卻，于490 nm波長測定吸收度值，測得多糖得率及質(zhì)量。

2.4 螺旋藻多糖提取率EY的計算

式中，x0－提取前螺旋藻的質(zhì)量，xt－提取多糖的質(zhì)量

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗及結(jié)果 各個因素實驗時，螺旋藻的投入量均為5.00 g。料液比為1∶20，超聲波功率320 W，溫度40℃，提取時間為30 min，考察某一個因素時，其他因素固定上述值。

3.1.1 考察超聲作用時間對提取率的影響 從螺旋藻多糖提取結(jié)果(見圖1)看，短時間(小于30 min)超聲處理時提取率較低;延長處理時間至40 min，提取率快速增加并達到峰值(3.49%)。再增加時間，提取率則迅速下降。由于螺旋藻多糖主要存在于細胞間和細胞壁中，超聲處理時間太短(小30 min)不足以破碎細胞，釋放多糖;結(jié)果數(shù)據(jù)表明，作用時間在30～50 min，對多糖的提取效果較好。

圖1 超聲作用時間對螺旋藻多糖提取率的影響

3.1.2 考察超聲功率對提取率的影響 見圖2。圖2表明，隨著超聲功率的提高，多糖的提取率隨之增大，原因如下對于一定頻率和一定發(fā)射面的超聲來說，功率增大，聲強隨之增大。如果聲強增大，聲壓幅值以及液體中壓力亦增大，空化泡崩潰所需的時間將變得更短，也就是說單位時間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化時間增多，從而有利于植物藥有效成分提取率的提高。在超聲功率為200 W～280 W范圍內(nèi)，多糖提取率隨超聲功率的提高而增大，當超聲功率為280 W時，多糖的提取率為3.34%。

圖2 超聲功率對螺旋藻多糖提取率的影響

3.1.3 考察提取溫度對提取率的影響 見圖3。

圖3 提取溫度對螺旋藻多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，螺旋藻多糖的提取率也逐步上升，當提取溫度達到60℃時，提取率達到最高并趨于平衡。升高溫度有利于提取率的提高，一般來說，溫度升高，溶劑的表面張力系數(shù)及黏滯系數(shù)下降，蒸汽壓升高，超聲空化閾值下降，有利于空化泡的產(chǎn)生，但是另一方面，由于蒸汽壓的增大，導致空化強度或空化效應下降，從而不利于提取過程的強化。從超聲空化引起對提取率提高的角度來說，應該在較低的溫度條件下工作。

3.1.4 考察固液比對提取率的影響 見圖4。

圖4 固液比對螺旋藻多糖提取率的影響

由圖4可知，溶劑用量的適當增大有利于多糖提取率的提高，當固液比達到1∶30以后，再提高固液比，多糖提取率增加不是那么明顯?？紤]到溶劑利用的經(jīng)濟效益以及后序工藝能耗問題，在合適的范圍內(nèi)選擇較小的固液比較適宜。3.2 正交實驗結(jié)果與分析 以超聲提取時間、超聲功率、固液比和提取溫度為因素，每個因素設定3個水平設計(見表1)，考察超聲提取螺旋藻多糖的工藝，結(jié)果見表2，表3。

表1 超聲強化提取螺旋藻多糖的正交表頭設計

表2 超聲強化提取螺旋藻多糖的正交實驗結(jié)果

表3 超聲強化提取螺旋藻多糖的正交方差分析表

由表2、3可以看出，影響超聲提取螺旋藻多糖的4個因素(溫度、超聲功率、提取固液比、提取時間)中，溫度的影響最大，超聲功率的影響最小，其影響多糖提取率的大小次序先后為:A＞C＞D＞B，即溫度＞提取固液比＞提取時間＞超聲功率。綜合考慮經(jīng)濟效益的因素，得出各因素的優(yōu)化工藝參數(shù)為:提取溫度50℃，提取功率320 W，固液比1∶25，提取時間50 min。

3.3 驗證實驗 稱取螺旋藻粉末5.00 g，在提取溫度50℃，提取功率320 W，固液比1∶25，提取時間50 min條件下重復實驗3次，分別測得螺旋藻多糖的提取率為3.287 6%、3.301 2%和3.297 2%，平均提取量為 3.295 3%，可見所確定的提取工藝能用于螺旋藻多糖的提取。

3.4 超聲提取與常規(guī)提取法的對比研究 超聲提取按3.2項的最佳提取工藝進行，根據(jù)文獻［6］常規(guī)回流提取法:采用傳統(tǒng)熱水法提取螺旋藻多糖，螺旋藻5.00 g，提取時間4 h;提取溫度60℃;提取固液比1∶15。見表4。

表4 兩種提取方法的比較

從表4實驗結(jié)果可知，超聲提取與常規(guī)熱水萃取的最大差別表現(xiàn)在提取時間和提取率這兩方面。超聲提取法的多糖提取率高于傳統(tǒng)熱水提取法的40% 以上，所需時間大大縮短。

4 討論

將超聲技術(shù)應用于螺旋藻多糖的提取，能夠增加糖類物質(zhì)的得率。文中探討了與超聲波作用效應相關(guān)的超聲功率，提取時間，固液比，提取溫度4個因素對多糖提取率的影響，同時采用正交實驗確立最佳條件。正交優(yōu)化條件為超聲功率320 W，時間50 min，固液比1∶25，溫度50℃，在這個最佳條件下多糖提取率是3.295 3%。與傳統(tǒng)水提方法比較，超聲提取具有迅速、節(jié)能、操作簡便、提取率高等優(yōu)點，是一種較好的螺旋藻多糖提取的新工藝。超聲技術(shù)提取多糖等天然產(chǎn)物將有良好的應用前景。

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