梁巧蘭, 魏列新, 徐秉良*, 師桂英

(1.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,蘭州 730070;2.甘肅農業(yè)大學農學院,蘭州 730000)

三種化學物質誘導觀賞百合對黑斑病抗性的研究

梁巧蘭1, 魏列新1, 徐秉良1*, 師桂英2

(1.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,蘭州 730070;2.甘肅農業(yè)大學農學院,蘭州 730000)

[目的]確定水楊酸、納米硅、草酸銨等3種化學物質對觀賞百合黑斑病抗病性的誘導效果,為百合生長期病害的防治提供理論依據。[方法]測定3種化學物質對觀賞百合黑斑病菌的抑菌活性和誘導寄主抗性效果。[結果]3種化學物質對觀賞百合黑斑病菌抑菌率較低,最高僅為5.43%,但處理百合葉片后,誘導百合產生較高抗病性。在100、50 μ g/mL和25μ g/mL濃度下,納米硅的誘導抗病效果最好,分別為55.55%、60.69%、48.57%。水楊酸誘導處理可使觀賞百合葉片β-1,3-葡聚糖酶在第1天達到峰值,納米硅可以使過氧化物酶在第5天達到峰值,草酸銨可以使苯丙氨酸解氨酶在第5天達到峰值,分別為對照的3.95倍、2.10倍和1.15倍;先誘導處理再接種黑斑病菌1 d后葉片組織內β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性均明顯高于對照;水楊酸、納米硅和草酸銨處理7 d后田間誘導防病效果分別為35.38%、43.55%和 31.07%;處理14 d后,與第7天相比誘導防病效果明顯降低。[結論]水楊酸、納米硅和草酸銨3種化學物質對百合均有一定誘導抗病作用,其中納米硅酸的誘導抗病效果最好,可達到48%以上。

化學物質; 觀賞百合; 黑斑病; 誘導抗性

觀賞百合是世界上著名的球根花卉,植株剛直挺秀、清雅脫俗、芳香宜人,是目前國際市場上十分暢銷的花卉之一。觀賞百合黑斑病發(fā)生普遍[1],調查發(fā)現田間平均發(fā)病率為63.67%。觀賞百合黑斑病由半知菌鏈格孢(Alternaria alternata)引起,在葉片上形成圓形或不規(guī)則形褐色病斑,嚴重時整葉枯死,植株一生均可受害,嚴重影響植株的光合作用,使其觀賞價值降低。

長期以來,生產上主要采用化學藥劑進行防治,而化學藥劑防治存在農藥殘留、污染等問題,使切花的價值降低,同時影響人類健康。而誘導抗病性是指植物在各種誘導因子的作用下,使植物體內與抗病有關的基因得到表達,從而產生抗病性,即系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance,SAR)[2-5]。目前,植物誘導抗病性為植物病害的防治開辟了一條新途徑。利用化學誘抗劑水楊酸、納米硅、草酸鉀誘導植物抗病性已有報道[6-7]。本試驗選用水楊酸、納米硅、草酸銨這3種化學物質對觀賞百合黑斑病誘導抗性進行了研究,旨在確定這3種化學物質對觀賞百合黑斑病抗病性的誘導效果,為百合生長期病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

觀賞百合黑斑病菌(Alternaria alternata)由甘肅農業(yè)大學農藥實驗室從田間發(fā)病的葉片分離、純化、鑒定并保存在 PDA斜面培養(yǎng)基上,4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試材料

水楊酸(SA)(天津光復精細化工研究所,含量99%)、納米硅(舟山明日納米材料有限公司生產,化學純,平均粒徑為15 nm,比表面積160 m2/g)、草酸銨(天津光復精細化工研究所,含量99%);觀賞百合,品種為‘西伯利亞’。

1.2 3種化學物質對觀賞百合黑斑病菌抑菌活性測定

將水楊酸、納米硅、草酸銨用滅菌水分別配制成100 μ g/mL ×50 倍 、50 μ g/mL ×50 倍 、25 μ g/mL×50倍3個濃度,在無菌條件下取1 mL不同濃度的藥液加入49 mL PDA培養(yǎng)基中搖勻后倒入4個培養(yǎng)皿中,以滅菌水作對照,做好標記;在無菌操作條件下將經過PDA活化培養(yǎng)4 d的百合葉斑病菌用滅過菌的打孔器沿菌落邊緣制成菌餅,并將菌餅接種于冷卻后的含藥PDA上,在24℃恒溫箱內培養(yǎng)96 h后,用十字交叉法測定菌落的直徑,并按下式計算不同化學物質的抑菌率。

1.3 3種化學物質對觀賞百合誘導抗病性測定

用上述不同濃度水楊酸、納米硅、草酸銨噴霧處理現蕾期觀賞百合健康葉片,3 d后采用噴霧法接種濃度為1×104個/mL供試鏈格孢,用清水作對照,每個濃度處理3株,重復3次;然后24℃保濕培養(yǎng),接種一周后根據以下癥狀分級標準(參考農藥田間藥效試驗準則,略有修改)[8]調查發(fā)病情況,并按以下公式計算病情指數和誘導抗病效果。

百合黑斑病癥狀分級標準:0級,無癥狀;1級,病斑占葉面積25%;2級,病斑病斑占葉面積26%～50%;3級,病斑占葉面積51%～75%;4級,病斑占葉面積76%～100%。

1.4 3種化學物質對觀賞百合病程相關蛋白活性的影響

1.4.1 試驗方法

用50 μ g/mL的水楊酸、納米硅和草酸銨以葉面噴霧的方式處理百合植株,以清水為對照,每種物質處理6株,每處理重復2次,3 d后將經過化學物質和清水處理的百合植株分成兩組,其中一組采用噴霧法接種濃度為1×104個/mL供試鏈格孢,另一組噴施清水,24℃下保濕培養(yǎng),然后分別于化學物質處理后1、3、5、7 d及接種后1 d,采集經處理的觀賞百合葉片進行酶活性測定。

1.4.2 酶液的提取、活性的測定及計算

分別參考El Ghaouth[9]和中國科學院上海植物生理研究所[10]的方法對β-1,3-葡聚糖酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)進行提取及酶活性測定。

POD的提取采用袁慶華等[11]方法。POD的測定采用愈創(chuàng)木酚作底物,用分光度法測定生成物的含量,在470 nm波長下測定吸光值。以1 mL去離子水代替H2O2為對照[10]。

在上述反應條件下,以每分鐘每克鮮樣A值變化1.00所需的酶量為一個酶活單位(U)。各樣品均測定2次,3個重復。

1.5 3種化學物質對觀賞百合田間誘導防病效果測定

將用3種化學物配成濃度為50 μ g/mL的溶液,噴霧處理田間現蕾期觀賞百合,以不同化學物質作為處理,每個處理30株,重復 3次,以清水噴霧為對照。分別于處理前和處理后7、14 d按1.3中分級標準采用5點取樣法,每樣點10株,隨機調查60個葉片,并按下式計算田間發(fā)病率、病情指數(同1.3)及誘導防治效果[8]。

2 結果與分析

2.1 3種化學物質對觀賞百合黑斑病菌抑菌活性

抑菌活性測定結果表明水楊酸、納米硅和草酸銨對觀賞百合黑斑病菌的抑制作用較低,當濃度為100 μ g/mL時3種化學物質的抑菌率最高,分別為1.12%、2.47%和5.43%,隨著濃度的降低抑菌率逐漸降低,而當草酸銨濃度為25 μ g/mL時,對鏈格孢不僅無抑菌作用而且表現出刺激生長作用(表1)。

2.2 3種化學物質誘導觀賞百合抗黑斑病效果

誘導抗病性試驗結果表明,不同處理的觀賞百合黑斑病發(fā)生情況不同。經DPS3.0軟件 LSD方差分析結果表明,同一化學物質不同濃度處理的病情指數和對照的病情指數之間均存在顯著差異,而且3個濃度處理的病情指數之間也存在顯著差異,其中濃度為50 μ g/mL時3種化學物質處理的病情指數均低于其他兩個濃度處理的。同一濃度不同化學物質處理的病情指數和對照的病情指數之間均存在顯著差異,濃度為100 μ g/mL時,納米硅處理的病情指數和水楊酸、草酸銨處理的病情指數之間存在顯著差異,而水楊酸、草酸銨處理的病情指數之間差異不顯著;濃度為50 μ g/mL時,3種化學物質處理的病情指數之間也存在顯著差異;濃度為25 μ g/mL時,水楊酸處理的病情指數和納米硅、草酸銨2種化學物質處理的病情指數之間存在顯著差異,而納米硅、草酸銨2種化學物質處理的病情指數之間差異不顯著。統(tǒng)計分析結果表明,所選用的3種化學物質對百合葉片抗鏈格孢菌均有一定誘導作用,在 3種濃度下納米硅誘導效果最高,分別為55.55%、60.69%、48.57%;水楊酸的誘導效果與草酸銨的相差不大。濃度為 50 μ g/mL時,水楊酸、納米硅和草酸銨誘導抗病效果最好,分別為52.41%、60.69%和 57.58%(表1)。

表1 3種化學物質對觀賞百合黑斑病菌的誘導抗病效果1)

2.3 3種化學物質對觀賞百合病程相關蛋白活性的影響

2.3.1 3種化學物質對β-1,3-葡聚糖酶活性的影響

濃度為50 μ g/mL的3種化學物質誘導處理后,百合葉片組織內β-1,3-葡聚糖酶活性有明顯變化(圖1)。水楊酸處理后第3天百合葉片中酶活性達最大值,納米硅和草酸銨處理后第7天百合葉片中酶活性達最大值。分別是對照的2.32、1.23倍和1.61倍;接菌后1 d,誘導處理的酶活性分別是對照的3.95、1.06倍和4.17倍。通過對3種化學物質誘導處理結果比較,發(fā)現水楊酸處理觀賞百合葉片后,β-1,3-葡聚糖酶活性增加較快,1 d時的酶活性高于對照及其他兩個處理。表明水楊酸較易誘導β-1,3葡聚糖酶活性的提高。

圖1 3種化學物質對百合葉片β-1,3葡聚糖酶活性影響

2.3.2 3種化學物質對過氧化物酶(POD)活性的影響

經水楊酸、納米硅和草酸銨誘導處理1 d后、3 d后和接種1 d后,百合葉片組織內POD活性明顯高于對照,分別為對照的 1.25、1.13、1.16倍,1.31、1.69 、1.51倍和 1.60、1.46、1.80 倍;納米硅誘導處理5 d后,百合葉片組織內 POD酶活性達到最大值,為對照的2.10倍,之后酶活性略有下降(圖2)。

2.3.3 3種化學物質對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

草酸銨誘導處理后,不同處理時間百合葉片組織內PAL活性呈先升后降的變化趨勢(圖3),在第5天酶活性達到最大值,為對照的1.15倍,水楊酸、納米硅處理的酶活性和對照相差不大;接種后1 d水楊酸、納米硅和草酸銨處理的酶活性均高于對照,分別為對照的1.87、1.64倍和1.76倍(圖3)。

2.4 3種化學物質對觀賞百合田間誘導防病效果

田間誘導防病效果測定結果表2表明,3種化學物質對觀賞百合抗黑斑病均有一定的誘導防治作用,處理后7 d的誘導防病效果均達到30%以上,其中納米硅的誘導防治效果最好為43.55%,水楊酸次之,草酸銨最低;誘導處理14 d后發(fā)病率和病情指數低于處理前而高于處理后7 d的,水楊酸、納米硅和草酸銨的誘導防病效果分別比處理后7 d的防病效果降低了42.23%、48.57%和39.42%。

表2 3種化學物質對觀賞百合黑斑病田間誘導防治效果

3 結論與討論

水楊酸、納米硅和草酸銨3種化學物質對百合葉片抗鏈格孢菌均有一定誘導抗病作用,其中納米硅的誘導抗病效果最好,可達到48%以上。

有研究表明,β-1,3-葡聚糖多聚體是大多數植物病原真菌細胞壁的主要成分之一,而β-1,3-葡聚糖酶通過催化β-1,3-葡聚糖多聚體的水解,將其降解為葡萄糖,從而抑制真菌的生長及增殖[12];POD是植物體內普遍存在的氧化還原酶,它不僅參與了木質素、酚類物質及植保素的合成,還作為整個代謝途徑的調節(jié)子,通過影響植物體內多種代謝途徑而在抗病性中起作用,是與植物抗病有關的一種重要酶[13-14]。PAL活性與植物抗病性密切相關,其活性可作為衡量植物抗病性的生化指標之一。植物感染病原菌后PAL活性明顯升高,并表現出規(guī)律性的變化,如張淑珍等在對疫霉根腐病菌毒素脅迫下不同大豆抗感品種PAL活性的研究中發(fā)現,抗病大豆品種的根、莖和葉中PAL活性在病程的大部分階段都高于對照[15],PAL的植物抗病機制主要表現為參與植保素、木質素和酚類物質的合成[16]。由此可見這3種酶活性的提高是植物抗病性增強的具體表現。本試驗結果也表明經水楊酸、納米硅、草酸銨誘導處理后,觀賞百合葉片組織內病程相關蛋白酶 β-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL活性均在短時間內提高,表現出規(guī)律性變化,且明顯高于對照,表明這3種化學物質能夠激活觀賞百合葉片的防御體系,使百合葉片產生了對葉斑病的抗性;3種化學物質處理后,β-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL變化規(guī)律不同,水楊酸處理可使百合葉片中的β-1,3-葡聚糖酶在短時間內達到峰值,納米硅和草酸銨處理又分別能夠使POD和PAL在第5天達到峰值,這表明3種化學物質對觀賞百合抗黑斑病的誘導機制可能存在差異,本試驗尚未涉及;另外,田間試驗結果表明3種化學物質對觀賞百合抗黑斑病有一定的誘導防治效果,但隨著時間推移誘導防病效果明顯降低,對于這3種化學物質的最佳誘導時間、誘導抗病性持效期以及能否誘導觀賞百合葉片產生對其他葉部病害的抗性等問題還有待于進一步研究。

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Resistance of ornamental lily against Alternaria alternata induced by threechemicals

Liang Qiaolan1, Wei Liexin1, Xu Bingliang1, Shi Guiying2
(1.College of Grassland Science/Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education/Sino-U.S.Center for Grazingland Ecosystem Sustainability,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China;2.College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China)

chemicals; ornamental lily;Alternaria alternata; induced resistance

S 432.23;S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.007

2010-03-05

2010-03-22

甘肅省農牧廳生物技術專項(GNSW-2009-04,GNSW-2005-14);甘肅省教育廳項目(0702B-01);蘭州市科委項目(03-1-39)

*通信作者E-mail:xubl@gsau.edu.cn

[Objective]The induced resistance effect of salicylic acid(SA),nanometer silicon and ammonium oxalate for lily toAlternaria alternatawere evaluated so as to provide the basis for control of lily diseases.[Method]The inhibitory bioactivity and the induced resistance of ornamental lily toA.alternataelicited by three chemicals were tested.[Result]The inhibitory effects of salicylic acid(SA),nanometer silicon and ammonium oxalate toA.alternatawere very weak,and the rates of inhibition were less than 5.43%.When treated at the concentration 100 μ g/mL,50 μ g/mL and 25 μ g/mL of nanometer silicon,the induced resistance to lily leaves reached 55.55%,60.69%and 48.57%,respectively.The enzyme activity of β-1,3-glucosan reached the maximum in one day when lily leaves were treated bySA,while the enzyme activity of POD induced by nanometer silicon and PAL induced by ammonium oxalate reached the maximum in five days,which were 3.95,2.10 and 1.15 times as those of control,respectively.The enzyme activity of β-1,3-glucosan,POD and PAL enzyme of lily leaves were higher than that of the control when lily leaves were treated with 50 μ g/mL of the three chemicals and then inoculated withA.alternata.The induced resistance to lily leaves elicited by the three chemicals after seven days reached 35.38%,43.55%and 31.07%,respectively.After fourteen days,the induced resistance to lily leaves was decreased significantly,compared with that elicited by the three chemicals after seven days.[Conclusion]Salicylic acid(SA),nanometer silicon and ammonium oxalate had induced resistance effects to lily to some extent,among which,nanometer silicon had the best effect of over 48%.