趙夢(mèng)楠，劉宗昂，王艦

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)七年制94期，遼寧沈陽(yáng)110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)93期，遼寧沈陽(yáng)110001;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病原微生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001)

普通人群中約30%的肺炎是由肺炎支原體引起的，肺炎支原體感染引起的呼吸道損害及各種肺外并發(fā)癥已引起廣泛關(guān)注。P1蛋白在肺炎支原體感染過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。本文針對(duì)肺炎支原體P1蛋白的基因結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制和實(shí)驗(yàn)室診斷方法的最新研究進(jìn)行綜述。

1 P1基因結(jié)構(gòu)與分型

1.1 P1的分子結(jié)構(gòu)

MP基因組的全序列分析(NCBL gene bank)表明P1基因可分為A-N共14個(gè)區(qū)，其中單拷貝區(qū)為F、G、L、M 4個(gè)區(qū)，其余為多拷貝區(qū)。由4 884個(gè)堿基組成的Pl蛋白結(jié)構(gòu)基因位于MP基因組第180 858～185 741位的單拷貝區(qū)，其中A+T含量約46 mol%，該基因的編碼產(chǎn)物是由1 627個(gè)氨基酸組成的蛋白。P1結(jié)構(gòu)基因受P1操縱子調(diào)控。P1操縱子的基因序列是在P1基因和2個(gè)開(kāi)放讀碼框架(ORF)之間分別插入了12個(gè)和5個(gè)堿基，即ORF4→P1→ORF6。另外ORF5編碼產(chǎn)生P1蛋白;ORF4編碼產(chǎn)生一種Mr約為28×103的蛋白質(zhì)，其作用尚不明確;ORF6編碼產(chǎn)生2種Mr分別為40×103和90×103的膜蛋白，其作用與細(xì)胞黏附相關(guān)。

黏附素P1可以調(diào)控致病性肺炎支原體與呼吸道上皮細(xì)胞之間的識(shí)別作用。P1蛋白基因包含21個(gè)編碼色氨酸的UGA密碼子，而UGA本身又是一個(gè)終止密碼子，因此這些UGA密碼子的存在使P1蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)變得困難。為了避免這些問(wèn)題，可以在大腸埃希菌中表達(dá)P1蛋白的2個(gè)不同區(qū)域—1個(gè)N末端(P1-N1)和1個(gè)C末端(P1-C1)，這2個(gè)區(qū)域被認(rèn)為具有免疫優(yōu)勢(shì)，起到黏附素作用。將這些片段中的UGA密碼子修飾成UGG，則該基因被克隆后能夠在大腸埃希菌中表達(dá)。Rama Chaudhry等［1］通過(guò)實(shí)驗(yàn)定位了P1中的一段關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)P1蛋白的COOH端富含脯氨酸(最后的26個(gè)氨基酸中有13個(gè)是脯氨酸)，這可能是其COOH末端附著在黏膜上的原因，與這些序列相鄰的基因片段與肺炎支原體黏附素的生物機(jī)能相關(guān)，且具有高度免疫原性。他們還通過(guò)蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)P1蛋白C末端區(qū)域與肺炎支原體IgG抗體呈陽(yáng)性的患者血清顯示明顯的相關(guān)性，但是N末端相關(guān)區(qū)域沒(méi)有顯示相關(guān)性，這說(shuō)明C末端區(qū)域能產(chǎn)生免疫原。此外有研究表明與P1-C1重疊的P116片段產(chǎn)生的抗體(anti-P116)阻斷了肺炎支原體對(duì)呼吸上皮細(xì)胞的黏附作用，但未能檢測(cè)出該蛋白與患者血清發(fā)生免疫反應(yīng)。

1.2 P1變異體—孤立島3

肺炎支原體中新發(fā)現(xiàn)的一種P1變異體被稱(chēng)為孤立島3(isolate 3)。對(duì)于這部分基因，不同的學(xué)者有不同的見(jiàn)解。Stephanie B.等［2］用HRM(High-resolution melt)分析法對(duì)這部分P1基因進(jìn)行測(cè)序，孤立島3顯示為一種以P1為核心的、介于亞型1與2之間的“中間型”基因型。Spuesens E.B.等［3］認(rèn)為亞型1與2可以根據(jù)每個(gè)RepMP(P1基因中的重復(fù)DNA片段，同時(shí)也存在于肺炎支原體基因組的其他部分)的序列類(lèi)型加以區(qū)分，因此亞型1和2代表了進(jìn)化株的譜系，每一種P1變異株可以解釋為RepMP之間的基因組內(nèi)同源DNA再結(jié)合。

但同時(shí)Stephanie B.等［2］用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析法解釋孤立島3的P1序列，并與RepMP序列進(jìn)行比較，認(rèn)為孤立島3與亞型2中被命名為2b的株是一致的。該序列中被推斷為同源DNA再結(jié)合的過(guò)程把P1基因RepMP中的RepMP2/3-a序列轉(zhuǎn)換成了RepMP-d，因此，根據(jù)Spuesens的分類(lèi)方案，孤立島3可以被歸類(lèi)為2-P1類(lèi)型的序列，這種分類(lèi)與通過(guò)PCR限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析得出的把孤立島3作為亞型2株的分類(lèi)方法一致。而Emiel［4］則認(rèn)為孤立島3明顯不含有介于亞型1與2之間的中間型基因。

2 P1的致病機(jī)制

肺炎支原體的發(fā)病機(jī)制被部分歸因于過(guò)度的免疫反應(yīng)，其通過(guò)黏附蛋白黏附到相關(guān)細(xì)胞表面，激發(fā)某種信號(hào)從而引起特異性細(xì)胞骨架的蛋白重排，穿過(guò)胞膜并在胞質(zhì)中大量復(fù)制，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞受損與死亡［6］。但黏附作用與免疫反應(yīng)之間的相互作用機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為與細(xì)胞分裂、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、黏附作用、滑行運(yùn)動(dòng)等有關(guān)［7］。

2.1 黏附作用與相關(guān)蛋白

MP的黏附作用由一種特殊的頂端黏附細(xì)胞器調(diào)控，需要一系列復(fù)雜的肺炎支原體蛋白聚集于黏附細(xì)胞器上，包括主要表面蛋白P1(170 ku)、P30(30 ku)、P116、HWM1～HWM5以及蛋白質(zhì)A、B、C。這些蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上相互協(xié)調(diào)，使肺炎支原體的主要表面黏附素在HMW蛋白的輔助下在細(xì)胞器的頂端呈現(xiàn)極端聚集。主要蛋白P1和P30可能直接參與黏附，而HMW蛋白和A、B、C蛋白為輔助蛋白，為某些功能所必須，不直接參與黏附。黏附素P1和P30被認(rèn)為有明顯的免疫原性［8］，如果缺乏這些蛋白，Pl則不能準(zhǔn)確定位于頂端結(jié)構(gòu)，其變?yōu)槌墒斓鞍椎倪^(guò)程也將延緩。例如丟失HMW1的M6型突變株頂端變?yōu)槁褕A形，P1只散布于MP細(xì)胞表面;在有HMW1等位基因表達(dá)的M6型突變重組體中P1聚集于一極，接近正常形態(tài)。在丟失HMW2的突變體中，HMWl、HMW3、P65等蛋白更新加速，P1定位異常;在有HMW2等位基因的重組轉(zhuǎn)化株中，HMW2基因表達(dá)產(chǎn)物水平較低，只能介導(dǎo)血細(xì)胞吸附作用。HMW3突變株也出現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象［9］。Svenstrup等［10］證實(shí)這些黏附相關(guān)蛋白是按HMW1-HMW3-P1-P90-P65的順序組裝到MP附屬結(jié)構(gòu)上的，用免疫熒光顯微鏡可以檢測(cè)到MP頂端結(jié)構(gòu)中有3個(gè)獨(dú)特的亞細(xì)胞蛋白定位點(diǎn)，即HMWl-HMW3、P1-P90-P40和P30-P65。以上表明，黏附蛋白復(fù)合體在MP附屬結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和穩(wěn)定方面起到了重要作用。

黏附作用與炎癥反應(yīng)之間的相互作用已得到驗(yàn)證。具有黏附作用的肺炎支原體野生株產(chǎn)生前炎癥因子，如TNF-α、IL-1β，但是高溫致死的肺炎支原體或黏附作用缺陷的突變體明顯比野生株產(chǎn)生較少的前炎癥因子。肺炎支原體野生株以不依賴(lài)內(nèi)毒素的方式產(chǎn)生TNF-α和IL-1β的前驅(qū)體，同時(shí)也產(chǎn)生半胱天冬酶-1和ATP流出物，促進(jìn)IL-1β成熟，這表明肺炎支原體的黏附作用誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并與肺炎支原體的致病性有關(guān)，但是目前黏附作用在炎癥反應(yīng)中的具體作用仍不清楚［11］。

2.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與相關(guān)蛋白

目前普遍認(rèn)為由P1蛋白介導(dǎo)的黏附作用是通過(guò)NF-κB通路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3個(gè)與激活NF-κB相關(guān)的脂蛋白［11］，它們分別是MPN602、F0F1-ATPase的b亞族和二酯脂蛋白。F0F1-ATPase依賴(lài)于Toll-like受體(TLR1、TLR2和TLR6)激活NF-κB，將其他2種脂蛋白MPN161、MPN162分別指定為N-ALP1(NF-κB激活脂蛋白1)和N-ALP2(NF-κB激活脂蛋白2)，N-ALP1和N-ALP2通過(guò)TLR1和TLR2激活TLR信號(hào)，對(duì)N-ALP1和N-ALP2的功能分析［12］表明二者都是三酯脂蛋白。

在宿主細(xì)胞受到微生物感染的早期，具有模式識(shí)別功能的Toll-like受體在先天識(shí)別和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在10個(gè)TLR家族中，TLR2、TLR4、TLR5和TLR9與不同細(xì)菌成分的識(shí)別有關(guān)。各種微生物的肽聚糖、酵母聚糖和脂蛋白由TLR2識(shí)別，脂多糖、細(xì)菌的鞭毛蛋白和DNA分別由TLR4、TLR5、和TLR9識(shí)別。TLR家族通過(guò)包括骨髓變異蛋白、IL-1R激活酶、TNF相關(guān)受體因子6和NF-κB誘導(dǎo)酶在內(nèi)的IL-1R相關(guān)信號(hào)分子激活NF-κB通路。

3 與P1蛋白相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷法

肺炎支原體感染的快速確診對(duì)臨床和流行病研究都具有重要意義，但是目前常用的血清學(xué)方法只對(duì)提供回顧性診斷有幫助，且要求前后雙份血清抗體滴度有顯著提高，具有一定的局限性，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。利用肺炎支原體特異的P1蛋白基因作為診斷肺炎支原體感染的指標(biāo)是目前極有價(jià)值且簡(jiǎn)便實(shí)用的方法。

3.1 利用P1蛋白進(jìn)行的反向斑點(diǎn)雜交法

PCR具有敏感性高但假陽(yáng)性率也較高的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用方面有一定局限性。樊慧珍等［13］利用肺炎支原體特異的P1基因設(shè)計(jì)引物，用PCR合成一段162 bp的長(zhǎng)鏈DNA探針，通過(guò)反向斑點(diǎn)雜交法直接檢測(cè)病原體DNA。合成的162 bp DNA探針，具有高度特異性，只和肺炎支原體雜交，與其他細(xì)菌、病毒、真菌等無(wú)交叉反應(yīng)，而且長(zhǎng)鏈DNA探針在檢測(cè)基因組DNA方面的敏感性高于寡核苷酸探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該方法應(yīng)用于痰標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率顯著高于培養(yǎng)法。該雜交方法的建立為臨床微生物檢測(cè)開(kāi)辟了一條新途徑，在肺炎支原體感染的早期診斷方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，為臨床早期診斷MP感染提供了可能。

3.2 lambda顯示技術(shù)

lambda顯示技術(shù)(lambda display technology)是從患者血清中提取一個(gè)全基因的肺炎支原體文庫(kù)并在lambda噬菌體中進(jìn)行表達(dá)的技術(shù)。這種方法可以辨別出攜帶B細(xì)胞抗原決定簇的重組噬菌體，從而可以分辨出與宿主抗體反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)菌蛋白。在已知的肺炎支原體B細(xì)胞抗原中，黏附素P1和P30的免疫性得到最廣泛的認(rèn)可，并且它們的免疫優(yōu)勢(shì)表位已被人類(lèi)免疫球蛋白識(shí)別。

通過(guò)描繪該文庫(kù)識(shí)別出4種新的免疫原性的多肽，分別被MPN152、MPN426、MPN456和MPN500開(kāi)放讀碼框架編碼。這更加突出了lambda顯示技術(shù)在抗原和表面決定簇識(shí)別方面的作用。多肽MPN500有一個(gè)區(qū)域?qū)儆陴じ剿豍1蛋白家族，而lambda顯示技術(shù)恰好能夠識(shí)別蛋白MPN500的抗原區(qū)域。噬菌體克隆序列的MP-2.6短期多肽分析［5］表明來(lái)自同一個(gè)蛋白質(zhì)家族之間的其他黏附素相應(yīng)的序列變異性高，而MPN500包含一個(gè)能被肺炎支原體感染的患者抗體識(shí)別的免疫原性區(qū)，從而強(qiáng)調(diào)了該方法識(shí)別B細(xì)胞表位的有效性。細(xì)菌黏附作用中MPN500的功能，以及其在人類(lèi)宿主中的免疫反應(yīng)是有待進(jìn)一步探究的問(wèn)題。

綜上所述，P1蛋白在MP的致病中起到了重要作用，因此越來(lái)越多的學(xué)者致力于P1蛋白的研究。目前該研究已發(fā)展到從分子水平探討P1蛋白部分基因結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制以及在實(shí)驗(yàn)室診斷方面的應(yīng)用。但是P1基因的功能尚不完全明了，P1黏附素的具體致病機(jī)制尚不清楚，P1蛋白的研究為MP感染的診斷與防治開(kāi)辟了一個(gè)新的方向，但其實(shí)用性與安全性等仍值得探討。

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