王凱，劉洪艷，牟玲

(沈陽市傳染病院腎綜合征出血熱研究所，遼寧沈陽110006)

20世紀(jì)80年代，隨著DNA重組技術(shù)的不斷發(fā)展和抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)。近年來，治療性單克隆抗體發(fā)展迅速，已成為免疫治療的重要手段。據(jù)統(tǒng)計，目前有22個單克隆抗體已經(jīng)在美國被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療，超過200個單克隆抗體已在臨床實驗階段，并且保持著每年約14%的增長率［1-2］?？贵w庫技術(shù)問世已20余年，該技術(shù)為基因工程抗體領(lǐng)域帶來了廣闊的應(yīng)用前景?？贵w庫技術(shù)的核心是通過表型與基因型的偶聯(lián)，從構(gòu)建的抗體庫中找到編碼針對特異抗原的基因?？贵w庫技術(shù)由于篩選容量大、篩選能力強，可在體外表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，便于大規(guī)模生產(chǎn)，最有意義的是該技術(shù)可直接改善抗體的性能，獲取高親和力的抗體，因而成為開發(fā)抗體藥物最具發(fā)展活力的領(lǐng)域［3-4］。

1 噬菌體抗體庫的基因來源

已構(gòu)建的噬菌體抗體庫根據(jù)其來源可分為2大類，一類為免疫抗體庫，另一類為非免疫抗體庫。免疫抗體庫的抗體基因來源于抗原免疫的個體，因此不需要很大的庫容量即可從該類抗體庫中篩選到針對某一抗原的特異性抗體。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗體庫制備針對弱抗原、自身抗原及具有毒性抗原的抗體均無效，而且某一特定的抗體庫只能產(chǎn)生針對特定抗原的抗體，不能作為一個廣泛應(yīng)用的平臺［5］。

非免疫抗體庫不針對特定抗原，而是作為一個無偏向性的篩選平臺，因此必須具有很高的庫容量和多樣性［6］。目前，通過不同途徑得到的非免疫抗體庫有天然抗體庫、半合成抗體庫和全合成抗體庫。

天然抗體庫:其基因主要來源于B細(xì)胞，包括前、成熟、記憶B細(xì)胞，常從骨髓、脾、淋巴結(jié)、外周血中提取。為了獲取抗體基因，通常有3種設(shè)計思路:①在框架區(qū)FRl和FR4或J區(qū)(鉸鏈區(qū))設(shè)計引物，但此方法在引物區(qū)引入的氨基酸的突變可能對抗體的親和力有潛在影響;②設(shè)計套式PCR引物，先在信號肽和C區(qū)設(shè)計引物，克隆后測序，再在FR1和FR4區(qū)根據(jù)測序的結(jié)果設(shè)計引物，可獲得完全真實的V區(qū)序列，但信號肽序列變化較大，不易設(shè)計;③5＇-RACE或3＇-RACE，其中的特異引物可針對C區(qū)或polyA區(qū)，用此方法也可獲得完全真實的V區(qū)序列，而且不易漏過可用的抗體基因，可用于通用引物無法擴(kuò)增的雜交瘤細(xì)胞，但操作比較繁瑣［7-9］。

半合成抗體庫:以人工合成的部分可變區(qū)序列與另一部分天然序列組合。Ig輕重鏈各有3個高變區(qū)，其中由V(D)J基因在B細(xì)胞個體發(fā)生過程中重組形成的CDR3，序列變化大，特別是其長度，是決定抗體特異性的最重要因素，可從5個氨基酸到30多個氨基酸殘基。人胚系可變區(qū)的基因(含CDR1和CDR2)與通過人工合成編碼氨基酸的隨機引物置換的可變區(qū)中的CDR3組合，在體外模擬V(D)J重組構(gòu)建，成為半合成抗體庫。Winter小組［10］在最初的探索中，采用49個胚系的VH和人工合成的CDR3重組，配以單個Vk基因，構(gòu)建成庫容為2×107的抗體庫，后經(jīng)改造，采用組合感染法，得到庫容達(dá)6.5×1010的總抗體庫，成功地篩選到了多種特異性抗體。

全合成抗體庫:此抗體庫的出現(xiàn)得益于人類對抗體基因越來越深入的了解。全合成抗體庫人為地對抗體序列尤其是關(guān)鍵部位氨基酸序列進(jìn)行合理設(shè)計，減少無效克隆的產(chǎn)生，可獲得大量有功能抗體，從而表現(xiàn)出良好的發(fā)展優(yōu)勢。Knappik等［11］在2000年報道了第一個全合成抗體庫。他們根據(jù)抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)特點設(shè)計了7個VH和7個VL基因，其CDR為很容易置換的盒式結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了理想的表達(dá)載體，該載體不含干擾的酶切位點，所有元件很容易置換，并預(yù)留了構(gòu)建多種工程抗體或多價抗體的元件插入點。CDR的突變和隨機化采用了基于三聯(lián)核苷酸的突變法，7個VH和7個VL可組配成49個子庫。他們初步嘗試構(gòu)建了一個容量為2×109的全合成抗體庫，對數(shù)十種抗原進(jìn)行篩選，均得到了親和力較高的抗體。隨后一些學(xué)者又構(gòu)建了全合成ScFv噬菌體抗體庫［12］及Fab抗體庫［13］，選擇部分使用頻率較高的人抗體胚系基因家族的框架區(qū)基因進(jìn)行人工合成，同時人工設(shè)計合成6個半隨機CDR區(qū)，通過重疊拼接延伸PCR的方法合成抗體基因，使庫容明顯提高，而且70%以上為有功能的高親和力抗體。

2 噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵

2.1 PCR技術(shù)的發(fā)展

為了大量擴(kuò)增抗體基因片段，可設(shè)計一系列相應(yīng)引物，根據(jù)抗體中某些序列的相對保守性，利用不同的PCR技術(shù)簡單有效地擴(kuò)增出全套抗體可變區(qū)基因。一旦多樣的IgV區(qū)基因組能夠擴(kuò)增，從噬菌體抗體庫中即能得到針對不同抗原的高親和力抗體。1998年，Daniele Sblattero等［14］根據(jù)人類胚系基因數(shù)據(jù)庫(V BASE)設(shè)計一套引物，理論上可以擴(kuò)增所有可變區(qū)基因。隨著胚系基因數(shù)據(jù)的不斷完善和發(fā)展及PCR技術(shù)的成熟，套式PCR、5＇-RACE或3＇-RACE、單細(xì)胞RT-PCR不斷應(yīng)用于抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增，使得抗體的多樣性有了很大提高［15-17］。

2.2 利用大腸埃希菌成功分泌有功能的抗體片段

抗體分子與抗原的結(jié)合，其特異性主要依賴于復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)。大腸埃希菌無糖基化功能，不能表達(dá)具有效應(yīng)功能的抗體分子。在大腸埃希菌周質(zhì)腔中，能夠模擬分泌抗體的B細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化環(huán)境，抗體片段能夠有效表達(dá)并保持其親和力。在抗體片段如ScFv和Fab的可變區(qū)基因序列的5＇端加入細(xì)菌的信號肽序列，抗體片段即可分泌到周質(zhì)腔，并在那里完成折疊，成為有功能的蛋白質(zhì)分子。

2.3 有效篩選系統(tǒng)的建立

傳統(tǒng)的篩選方法使用固相化的純化抗原，依賴噬菌體顆粒對目的抗原的親和力差異來獲得較高親和力的抗體。而目前，可以在體外用完整的固化哺乳動物細(xì)胞、原核細(xì)胞和組織中的天然抗原篩選噬菌體抗體片段［18-19］，在進(jìn)行一維、二維電泳后，仍未能純化的抗原可以通過硝酸纖維素膜/PVDF膜進(jìn)行篩選，甚至在體內(nèi)進(jìn)行篩選。在體內(nèi)篩選的方法中，噬菌體被注入動物血管內(nèi)，非特異性地結(jié)合在所有器官的內(nèi)皮細(xì)胞上，由于無差異地結(jié)合在普通血管上而被稀釋，可用灌注的方式來移動其分布，這就使特異性結(jié)合在靶器官內(nèi)皮細(xì)胞上的噬菌體被分離出來，再取出該器官，即可得到目的噬菌體。此方法可以識別出器官的差異，但由于倫理學(xué)的約束，限制了此類技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。

3 噬菌體抗體庫技術(shù)的應(yīng)用

噬菌體展示技術(shù)一般用來制備2類抗體:一類抗體是用來識別人細(xì)胞的表面抗原的單克隆抗體，這類研究的主要目的是研究細(xì)胞蛋白分子的結(jié)構(gòu)和功能，研究疾病發(fā)病機理、治療方法以及腫瘤的治療。另一類抗體是用來識別病毒表面抗原的單克隆抗體，這類研究的主要目的是治療病毒性疾病、對病毒性疾病作臨床診斷或研究病毒致病機理。

由于膜蛋白密度的差異及膜分子暴露程度的不同，對未知抗原的分離鑒定具有很大困難，因而在很長一段時間內(nèi)抗體庫沒有被應(yīng)用于對腫瘤特異性抗體的篩選［20］。近年來，人們通過改進(jìn)篩選策略，用腫瘤作為靶抗原已從噬菌體抗體庫中篩選出許多腫瘤特異性抗體，利用抗腫瘤相關(guān)抗原的單抗與藥物前體、酶或細(xì)胞因子交聯(lián)，靶向定位到腫瘤局部，激活藥物前體使之轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒藥物，在腫瘤局部發(fā)揮細(xì)胞毒作用，以克服藥物所致的全身毒副反應(yīng)，或通過單抗介導(dǎo)提高腫瘤局部細(xì)胞因子濃度，研究已顯示了較好的靶向治療效果［21］。在目前尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和令人滿意的腫瘤相關(guān)抗原的情況下，以這種方法篩選抗腫瘤抗體很有價值。Wiiger MT等［22］利用人乳腺癌細(xì)胞株P(guān)M-1篩選人源全合成單鏈?zhǔn)删w抗體庫得到乳腺癌特異性單鏈抗體scFv173，可與細(xì)胞黏附分子CD166/ALCAM特異性結(jié)合。scFv173有2種特性:可抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲基底膜以及降低了腫瘤在小鼠模型中的增長。

在治療感染性疾病方面，噬菌體抗體庫技術(shù)已被應(yīng)用于登革病毒、乙肝病毒、SARS冠狀病毒的研究及單克隆抗體的制備。Cabezas S等［23］利用登革病毒單克隆抗體從被感染的Vero細(xì)胞中直接捕獲病毒顆粒作為抗原篩選人天然噬菌體抗體庫，獲得了一組特異性噬菌體抗體。Zhang JL［24］構(gòu)建了抗HBsAg抗體庫，得到2株陽性克隆，可溶性的抗HbsAg ScFv可特異性的與HbsAg結(jié)合。在SARS的研究中，篩選出2個抗核蛋白單克隆抗體和4個抗刺突蛋白單克隆抗體，其中1個抗核蛋白單克隆抗體可以識別一個人和所有動物都具有的保守的抗原表位，但抗核蛋白單克隆抗體不具有中和性;其中2個抗刺突蛋白S1的單克隆抗體具有很強的中和作用，能夠完全阻止SARS冠狀病毒對Vero易感細(xì)胞的攻擊，同時，研究還進(jìn)一步揭示抗刺突蛋白S1的N479殘基是與抗體結(jié)合的重要位點，這為SARS冠狀病毒感染的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)［25］。本法也用于輪狀病毒單克隆抗體的制備［26］。

自噬菌體抗體庫技術(shù)建立以來，這一技術(shù)為單克隆抗體的快速規(guī)?；苽溟_辟了一條全新的途徑。國內(nèi)外的一些實驗室先后建立了一批不同性質(zhì)的抗體庫。Brekke等［27］報道應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)的第一個抗體HUMIRA即D2E7(一種能有效控制RA癥狀，防止關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損壞發(fā)生的抗體)已經(jīng)通過了美國FDA的認(rèn)證。噬菌體抗體庫在感染性疾病、自身免疫病、多種癌癥及變態(tài)反應(yīng)性疾病的抗體靶向生物治療方面也得到了廣泛地應(yīng)用。

4 小結(jié)

噬菌體抗體庫技術(shù)生產(chǎn)的人源抗體為人類疾病的診斷和治療帶來了希望。噬菌體抗體對器官移植排斥反應(yīng)的防治及腫瘤的早期診斷、治療，以及手術(shù)及化療后晚期腫瘤的輔助治療均具有廣闊的應(yīng)用前景。不僅如此，噬菌體抗體庫技術(shù)在抗體人源化、抗體親和力提高、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等方面也顯示出獨特的應(yīng)用潛力。盡管噬菌體抗體庫技術(shù)使單克隆抗體的制備變得簡單易行，但目前還沒有廣泛普及并進(jìn)入臨床應(yīng)用。目前面臨的挑戰(zhàn)是，如何最大限度減少非特異性結(jié)合的同時。最大程度地富集到特異性好、親和力高的新抗體。隨著國內(nèi)外研究者對抗體庫技術(shù)的不斷改進(jìn)，噬菌體抗體庫技術(shù)必將給生物醫(yī)學(xué)研究及人類疾病的診治帶來深遠(yuǎn)的影響。

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