楊 澎，陳國強，陳雪觀

瘢痕攣縮是小兒燒傷后常見的并發(fā)癥。成纖維細胞的活躍代謝在瘢痕增生和攣縮過程中起著重要作用，其代謝受體內(nèi)多種細胞因子的調(diào)控。干擾素γ（interferonγ,IFN-γ）作為一類具有多種生物活性的細胞因子，在瘢痕的治療中的作用不斷為人們所重視。國內(nèi)外研究表明：IFN-γ可抑制瘢痕成纖維細胞的增殖分化，促進其凋亡，減少膠原合成及重構(gòu)[1-3]。本文旨在研究IFN-γ對小兒瘢痕組織成纖維細胞生物學性狀的影響，探討其在防治瘢痕攣縮中的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2009年8月—2010年10月嘉興市第二院燒傷整形科收治的15例瘢痕攣縮患兒，其中手指8例，肘關(guān)節(jié)3例，足背部1例，頸部1例，足趾2例。年齡0～12歲，平均8歲。均無結(jié)締組織疾??；無全身應用皮質(zhì)類固醇激素史；1年內(nèi)無瘢痕局部用藥及放療史；瘢痕表面潮紅或紫色，充血明顯，捫之堅硬，局部無潰瘍，均導致局部畸變。病程3～12個月，平均6個月。正常皮膚15例，取自鄰近正常皮膚。

1.1.2 主要試劑 新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、rhIFN-γ（上?？寺∩锛夹g(shù)有限公司)、四甲基偶氮唑(MTT（)Sigma美國)、二甲基亞砜（DMSO）（上海振興化工一廠）。

1.1.3 成纖維細胞的傳代培養(yǎng)[4]取SD大鼠尾部制備膠原,并采用組織塊法進行成纖維細胞原代培養(yǎng)。取第4～6代生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞，制成1×105/mL的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板（200 μL/孔），移入37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h（24 h后加入無血清DMEM培養(yǎng)液）。然后更換培養(yǎng)液：實驗組分別加入濃度為100、1 000、5 000、10 000、20 000 U/mL的rhIFN-γDMEM培養(yǎng)液；對照組加入DMEM培養(yǎng)液。再繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2 方法

1.2.1 細胞生長增殖測定 取上述96孔板，先加MTT溶液（20 μL/孔）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光(OD)值（波長570 nm）。

1.2.2 細胞周期的分析 取上述96孔板，分別制成單細胞懸液，離心（1 000 r/min，5 min）收集沉淀的細胞，用70%冰乙醇固定4℃保存18 h后，加入碘化丙錠（PI）綜合染液1 mL，室溫下避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)膜過濾，流式細胞儀測細胞周期。

1.2.3 膠原的測定 取上述96孔板，取培養(yǎng)液上清50 μL加入6 mol/L的鹽酸1.5 mL,130 ℃水解2 h，在100℃烤干后加入4 mol/L NaOH 1mL,氯胺T溶液1 mL，室溫放置30 min，加入高氯酸溶液1 mL放置5 min，加入10%對二甲氨基苯甲醛1 mL，65℃水浴振蕩顯色15 min，冷卻后分光光度計于560 nm測吸光度A。

1.2.4 FPCL收縮指數(shù)測定 取上述96孔板，用胰酶消化后制成含成纖維細胞的膠原網(wǎng)架(即fibroblast-populated collagen lattlice,FPCL)。加入15%的新鮮小牛血清DMEM 0.5mL/孔，每3 d換液1次。用透明座標紙測定培養(yǎng)后第6 d每一凝膠塊直徑的算術(shù)平均值，按下列公式計算出FPCL的收縮指數(shù)CI=[1-(D/D0)2]×100%。（D：凝膠塊最大直徑與最小直徑平均數(shù)，D0：初始直徑，33 mm）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗,P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 rhIFN-γ對成纖維細胞生長增殖的影響 實驗組加入rhIFN-γ 培養(yǎng)48 h后，100 U/mL、1 000 U/mL濃度組兩類成纖維細胞的OD值與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)；5 000 U/mL、10 000 U/mL、20 000 U/mL濃度組兩類成纖維細胞的OD值與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，詳見表1。

表1 rhIFN-γ對成纖維細胞OD值的影響（n=15，±s）

表1 rhIFN-γ對成纖維細胞OD值的影響（n=15，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01

組別rhIFN-γ劑量(U/mL)D570nm正常皮膚 攣縮瘢痕對照組實驗組0 100 1 000 5 000 10 000 20 000 0.539±0.017 0.535±0.032 0.523±0.027 0.451±0.034*0.402±0.025*0.388±0.032*0.545±0.026 0.543±0.030 0.533±0.030 0.491±0.027*0.417±0.033*0.396±0.022*

2.2 rhIFN-γ對成纖維細胞周期及膠原合成的影響 實驗組加入rhIFN-γ培養(yǎng)48 h后，100 U/mL、1 000 U/mL組處于G1期的成纖維細胞百分比與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；而5 000 U/mL、10 000 U/mL、20 000 U/mL濃度組處于G1期的成纖維細胞的百分比均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表2。

2.3 rhIFN-γ對FPCL收縮指數(shù)的影響 用含有不同濃度rhIFN-γ的培養(yǎng)液分別作用于FPCL后，各實驗組的收縮指數(shù)明顯下降，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表3。

表2 rhIFN-γ對各組G1期細胞百分數(shù)及膠原合成的影響（n=15，±s）

表2 rhIFN-γ對各組G1期細胞百分數(shù)及膠原合成的影響（n=15，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01

組別對照組實驗組rhIFN-γ劑量(U/mL)0 100 1 000 5 000 10 000 20 000 G1期百分數(shù)(%)57.651±2.872 58.535±2.711 59.691±3.572 75.839±3.680*86.383±2.477*92.042±3.364*膠原含量A560nm 0.146±0.012 0.083±0.005*0.064±0.014*0.061±0.008*0.059±0.017*0.058±0.011*

表3 不同濃度rhIFN-γ對EPCL直徑D的影響(mm，n=15，±s)

表3 不同濃度rhIFN-γ對EPCL直徑D的影響(mm，n=15，±s)

注：與對照組比較，*P＜0.01

組別對照組實驗組rhIFN-γ劑量(U/mL)0 100 1 000 5 000 10 000 20 000直徑(mm)11.520±1.440 18.240±1.792*24.247±2.075*25.493±2.223*26.633±1.913*27.293±1.476*CI(%)87.636±3.178 69.174±6.032*45.645±9.279*39.897±10.430*34.550±9.160*31.408±7.559*

3 討論

瘢痕攣縮是創(chuàng)傷愈合過程中瘢痕過渡收縮的表現(xiàn)，關(guān)于攣縮的動力源至今有著兩種不同觀點，一些研究認為，肌成纖維細胞是傷口收縮的動力源。據(jù)文獻報道[5-6]，傷口收縮時，成纖維細胞由遷徙型轉(zhuǎn)變?yōu)楹胸S富I、III型膠原和前纖維型，大約在傷后第9 d，發(fā)展成為終極型即肌成纖維細胞。Shin等[7]對肌成纖維細胞、成纖維細胞兩組細胞群收縮模型的測試也表明肌成纖維細胞是瘢痕收縮的強力源。另一些研究則認為，成纖維細胞是引起創(chuàng)面收縮的動力。Tredget[8]指出，代表肌成纖維細胞特征的α-SMA出現(xiàn)在傷后的第12～15 d，此時最活躍的傷口收縮活動已基本結(jié)束。劉建波等[9]在動物實驗研究中也發(fā)現(xiàn)，α-SMA陽性的肌成纖維細胞出現(xiàn)在創(chuàng)面收縮的高峰期之后?？傊徽撃姆N觀點，成纖維細胞的代謝在瘢痕的攣縮中均扮演重要的角色。

小兒的皮膚薄嫩，受傷后更易留下瘢痕。同時由于懼怕疼痛、自控力差等原因，患兒對瘢痕攣縮的對抗性功能鍛煉難以配合，常會殘留明顯的攣縮畸形。另外，小兒正處于生長發(fā)育的旺盛階段，瘢痕的彈性和延展性很差，若受傷后瘢痕增生及攣縮防治不及時，會限制患兒的生長發(fā)育甚至致殘，給患兒的成長及生活造成深遠的影響。

干擾素γ具有抑制細胞增殖，誘導細胞分化，增強自然殺傷和巨噬細胞活性等作用，但不影響正常細胞的功能[10-11]。目前認為，它在瘢痕組織中含量低下，是瘢痕增生的負性調(diào)節(jié)因子。文獻報道[12-13]，干擾素γ能在下調(diào)Smad 3表達的同時，上調(diào)Smad 7的表達，并能在拮抗轉(zhuǎn)化生長因子β1對成纖維細胞結(jié)締組織生長因子mRNA的上調(diào)作用,減少結(jié)締組織生長因子的表達水平，抑制TGF-β引起纖維化。

本實驗用含不同濃度IFN-γ的培養(yǎng)液對離體的成纖維細胞進行培養(yǎng)，當濃度較高（＞5 000U/mL）時，各實驗組成纖維細胞的OD值與對照組比較差異有顯著性。表明成纖維細胞的總數(shù)明顯減少，此時各組處于G1期的成纖維細胞的百分比明顯低于對照組，表明rhIFN-γ能阻斷或延緩成纖維細胞從G0期進入G1期再過渡到S期的過程，使的成纖維細胞處于DNA合成前期，細胞分裂增殖受到抑制。本實驗還進一步測定了各濃度組膠原含量及FPCL的收縮情況，并計算相應的CI。結(jié)果顯示，各實驗組膠原的合成和收縮指數(shù)均明顯減少。表明rhIFN-γ對成纖維細胞的膠原合成以及FPCL的收縮具有的抑制作用。抑制程度與rhIFN-γ濃度之間具有一定量效關(guān)系。

Cornelissen等[14-16]報道，IFN-γ通過下調(diào)I、Ⅲ 型膠原mRNA的表達，促進膠原酶的表達等途徑減少瘢痕中膠原的含量，還可以抑制肌成纖維細胞表達α-SMA的mRNA從而阻止向肌成纖維細胞分化。Tanaka等[17]的研究表明，IFN-γ治療瘢痕攣縮主要是在瘢痕形成的早期通過抑制肌成纖維細胞的形成而發(fā)揮作用的。筆者認為，IFN-γ通過抑制成纖維細胞的增殖分化，降低其代謝活性，進而減少膠原的合成及向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，達到抑制小兒瘢痕的增生及減輕瘢痕攣縮的作用。本實驗僅取材于小兒攣縮瘢痕的組織，對于不同年齡階段瘢痕作用的區(qū)別有待于進一步研究。

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