王樂丹,顏林志,孟銳鋒,張麗芳

2.溫州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,溫州 325000

沙眼衣原體感染小鼠生殖道模型的初步研究*

王樂丹1,顏林志1,孟銳鋒2,張麗芳2

目的建立沙眼衣原體(Ct)小鼠生殖道感染模型。方法分別用106、104、102數(shù)量IFU的CtE型株陰道內(nèi)接種雌性BALB/c小鼠,觀察外陰炎癥反應(yīng),檢測排菌情況,PCR檢測分泌物及對組織進行病理觀察。結(jié)果接種后第5d,實驗組小鼠即出現(xiàn)感染跡象;在接種后的5～20d均可在小鼠生殖道分離得到具感染性的Ct,但其持續(xù)排菌時期與接種的IFU數(shù)量成正比;且小鼠生殖道排菌量(IFU)與接種的IFU數(shù)量亦成正比,以106劑量組為高;小鼠生殖道分泌物PCR擴增后電泳,可見與CtMOMP分子量相當?shù)漠a(chǎn)物;小鼠生殖道組織切片觀察證實,CtE型株感染小鼠生殖道可產(chǎn)生生殖道炎癥。結(jié)論成功建立了小鼠生殖道E型Ct感染模型;l06IFU是建立模型的適宜感染量。

沙眼衣原體;動物模型;生殖道感染

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是最常見的性傳播疾病病原體之一,它在泌尿生殖系統(tǒng)引起多種器官的感染甚至導(dǎo)致不孕不育,然而其致病機制目前尚未完全明了。建立合適的動物模型對研究Ct致病機制、免疫、以及該病原體治療、藥物療效及毒性觀察、疫苗研究等方面有著重要意義,而國內(nèi)有關(guān)研究報告甚少,特就建立Ct小鼠生殖道感染模型作初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株CtE型株購自ATCC,含RPMI-1640生長培養(yǎng)基和蔗糖谷氨酸鉀稀釋液(SPG)。

1.2 動物6～8 w雌性BALB/c小鼠40只,購于溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心,均為清潔級,體重18～24g,隨機分為4組,每組10只,分籠顆粒飼料飼養(yǎng)并標記,飼養(yǎng)在溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心清潔級動物房,溫度保持在18℃～24℃,光暗周期 12h。

1.3CtE型株體外培養(yǎng)、制備感染液 用CtE型株感染Hep-2細胞,在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),收集單層感染Hep-2細胞,胰酶消化后反復(fù)凍融3次使細胞破碎,1 000r/min,離心10min沉淀細胞碎片,收集上清,并在4℃30 000r/min,繼續(xù)離心60min,取沉淀即為純化的Ct,用SPG置-70℃保存。

1.4Ct滴度的測定 在6孔細胞培養(yǎng)板中預(yù)置蓋玻片,將Ct接種于細胞單層,待包涵體形成后進行Giemsa染色,高倍鏡下(40×)觀察,鏡下計數(shù)50個視野,計算平均值,然后乘以654,既得全孔包涵體數(shù)目,并通過直線回歸推算出未稀釋時包涵體密度,即IFU/mL的數(shù)值[1-2]。

1.5 感染動物 4組(每組10只)BALB/c雌性小鼠在接種標本前先用無菌干棉簽陰道口旋轉(zhuǎn)幾次以擴開陰道口。隨機選取1組作為對照組,用培養(yǎng)Ct所用Hep-2細胞懸液(無Ct感染)50μ L接種,小鼠取倒置位15min,防止液體從陰道內(nèi)流出。另外3組隨機同法分別用含102、104、106IFU 的Ct感染液50μ L 接種。

1.6 感染觀察

1.6.1 炎癥反應(yīng) 觀察小鼠外陰有無紅腫、分泌物有無增加、分泌物顏色有無異常,并將實驗組和對照組進行比較。

1.6.2 排菌檢測 分別在感染后第5d、10d、15d、25d及30d,對所有小鼠取陰道宮頸拭子行病原學(xué)Hep-2細胞培養(yǎng)分離Ct,并進行IFU計數(shù)。Ct培養(yǎng)平均IFU評分:4,＞104IFU;3,103～104IFU;2,102～103IFU;1,＜102IFU;0,陰性。每組取 10只小鼠的平均值。采用Fisher's檢驗方法對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。

1.6.3 陰道分泌物中CtDNA的PCR檢測 根據(jù)Ct主要外膜蛋白DNA序列,設(shè)計引物:正向5′ACTAGTggATCCT T GCC AtggCT T Tg AgT TCT gC 3′,反向 5′GGTCTAGAAAgCT TgAAgCg gAA TTg TgC AT T TAC g 3′,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將-70℃保存的Ct裂解煮沸處理后取0.5μ L作為模板擴增,同法將Hep-2細胞收集液處理后作陰性對照。93℃預(yù)變性5min,93℃變性30s、55℃復(fù)性30s、72℃延長 1min共40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后,72℃延伸10min后終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6.4 病理觀察 于感染攻擊后第10d(取完陰道宮頸口拭子后)處死小鼠每組3只,解剖取出完整的生殖系統(tǒng)標本。迅速放入10%福爾馬林固定劑中,經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、脫蠟、染色,中性樹膠封片,晾干保存。

2 結(jié) 果

2.1 炎癥反應(yīng) 經(jīng)陰道接種感染后第5d,實驗組小鼠即出現(xiàn)感染跡象:外陰與陰性對照組相比見有紅腫,分泌物增加,如圖 1。

圖1 Ct感染組小鼠外陰炎癥變化注:Pre Ct為小鼠生殖道感染Ct前照片F(xiàn)ig.1 The appearance of genital inflammation in Ct infected-mice

2.2 排菌檢測 分別用 102、104、106IFU的CtE型株接種小鼠,發(fā)現(xiàn)在接種后的5～20d均可在小鼠生殖道分離得到具感染性的Ct,但其持續(xù)排菌時期與接種的IFU 數(shù)量成正比,分別為20、15、10d;且小鼠生殖道排菌量(IFU)與接種的IFU數(shù)量亦成正比,以106劑量組為高,具體結(jié)果見表1。

表1 雌性BALB/c小鼠陰道內(nèi)感染不同滴度Ct結(jié)果比較Table1 Intravaginal infection of BALB/c mice with various amounts of Ct

2.3 PCR檢測陰道分泌物 小鼠生殖道分泌物PCR擴增后電泳,可見與CtMOMP分子量相當?shù)漠a(chǎn)物,見圖2。

2.4 小鼠生殖道Ct感染后生殖器官病理改變 見圖3。

由上述病理切片可見,小鼠生殖道Ct感染后,輸卵管管壁慢性炎細胞浸潤、粘膜皺襞消失而變得平坦、薄,部分可見皺襞殘留;子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細胞、淋巴細胞浸潤,伴不同程度的水腫充血;宮頸間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞和漿細胞等慢性炎細胞浸潤,產(chǎn)生了輸卵管炎、子宮內(nèi)膜炎、宮頸炎等病狀。實驗證明106IFU接種劑量可使BALB/c小鼠感染Ct,成功建立小鼠Ct生殖道感染模型。

圖2 目的片段Ct MOMP PCR產(chǎn)物電泳分析1:Hep-2細胞感染小鼠分泌物PCR產(chǎn)物;2、3:Ct感染小鼠分泌物PCR產(chǎn)物;4:DL2000 ladderFig.2 PCR analysis of Ct MOMP1:Secretion PCR product of Hep-2 infection;2、3:Secretion PCR product of Ct infection;4:DL2000 ladder

圖3 各組小鼠輸卵管及子宮頸病理改變比較(3.1-3.6)3.1:對照組輸卵管;3.2:Ct感染組輸卵管(積水明顯);3.3:對照組子宮;3.4:Ct感染組子宮;3.5:對照組子宮頸;3.6:Ct感染組子宮頸Fig.3 The pathological changes of tubal and cervical in different mice groups(3.1-3.6)

3 討 論

Ct是性傳播疾病(STD)最常見的病原體之一,目前,Ct生殖道感染的發(fā)病率持續(xù)上升,在一些西方發(fā)達國家和國內(nèi)沿海地區(qū)其發(fā)病率已位居性傳播疾病之首。雖然Ct感染生殖道在人體所引起的臨床癥狀較輕、不典型,但發(fā)病機理復(fù)雜[3],而且因醫(yī)學(xué)倫理等問題,在人體研究其致病機理受到限制。所以動物模型的建立有利于發(fā)病機理、疫苗的免疫效應(yīng)和保護效應(yīng)、藥物的療效和毒性等研究。國外已有研究發(fā)現(xiàn),利用小鼠建立鼠型Ct生殖道感染模型與女性Ct生殖道感染非常相似,而且具有多重優(yōu)勢,適用于免疫學(xué)研究和對Ct感染引起的繁殖力變化的研究[4]。

但在小鼠Ct生殖道感染模型的構(gòu)建中,存在著許多影響因素,如小鼠種系、小鼠周齡、小鼠動情周期、感染Ct數(shù)量和接種方法等均對感染成功有影響。不同小鼠種系對Ct生殖道感染的敏感性不同,有學(xué)者對比BALB/c、C3H/HeN和C57BL/6 3種小鼠,認為C3H/HeN和C57BL/6小鼠對Ct感染的敏感性最高,BALB/c次之[5]。處于性活躍期的6～8w年幼成年鼠最容易感染成功[6]。這可能是多因素結(jié)果:性生理改變,免疫力成熟,多次暴露后的獲得性免疫等。隨著年齡的增長,年長成年鼠由于性和/或免疫機制成熟導(dǎo)致的生理改變在對衣原體感染的抵抗增強上起到重要的作用。在人群調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),Ct感染在性活躍的成年婦女中有較高的感染率,隨著年齡的增長,Ct感染率逐漸下降[7]。

關(guān)于Ct的感染劑量:Ct感染模型的實驗數(shù)據(jù)很大程度上受到Ct感染劑量的影響,感染劑量的多少直接影響到模型建立是否能夠成功。目前眾多文獻中所報道的感染劑量數(shù)量級,從104～107不等。一般來說,建立動物模型時,達到同樣的感染率,鼠型Ct比人型株Ct所需的感染劑量小[8]。對于適宜的感染濃度,陳木開等[9]研究發(fā)現(xiàn),鼠型Ct進行小鼠陰道內(nèi)接種時,用105IFU以下Ct陰道內(nèi)接種,不能使感染組小鼠出現(xiàn)明顯發(fā)病,而用105和107IFu接種小鼠,小鼠出現(xiàn)明顯發(fā)病,電鏡觀察到Ct存在于輸卵管病變組織。106IFU為合適的感染劑量。由此可見小鼠生殖道感染模型的建立受多方面因素的影響,不同的實驗室間也存在一定的差異,因此本部分小鼠生殖道感染模型的建立工作,對于本研究準確評價衣原體疫苗的免疫效果和保護性作用是非常必要的。

[1]王紅楓,劉全忠,齊蔓莉.沙眼衣原體 E血清型的小鼠生殖道感染模型初步研究[J].中華皮膚科雜志,2006,39(5):296-297.

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[3]陳輝,楊斌,鄭和平,等.泌尿生殖道沙眼衣原體分子流行病學(xué)研究進展[J].嶺南皮膚性病科雜志,2009,16(1):72-74.

[4]王紅楓,劉全忠.沙眼衣原體生殖道感染動物模型的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊,2005,31(2):127-129.

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[6]Pal S,Peterson EM,Maza M,et al.Susceptibility of mice to vaginal infection with Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis is dependent on the age of the animal[J].Infect Immune,2001,69(8):5203-5206.

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Preliminary study on the murine model for genital infection withChlamydia trachomatis

WANG Le-dan,YAN Lin-zhi,MENG Rui-feng,ZHANG Li-fang
(The2nd Af filliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou325000,China)

In order to found the murine model for genital infection withChlamydia trachomatis(Ct),female BALB/c mouse was inoculated with E-type strainCtby 106,104and 102IFU respectively.The inflammatory response,bacteriological yields,secretion PCR and histopathological change were observed.Five days after inoculation,inflammatory response emerged in experimental group,and hyperinfectiveCtcould be available in mouse's genital tract.The duration ofCtexcretion was closely in line with IFU quantity of inoculatedCt,and the quantity ofCtexcretion was also proportional to IFU amount.Secretion PCR could also get the similar molecular product,and the pathological reproductive tract infection was confirmed.In conclusion,mouse model ofCtgenital infection has been found successfully and 106IFU is the suitable amount for that.

Chlamydia trachomatis;animal model;genital infection

R374.1

A

1002-2694(2011)08-0692-04

*國家自然科學(xué)基金(30972669),溫州市科技局科研基金(Y20080119,Y20100090)資助項目

張麗芳,Email:wenzhouzlf@126.com

1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院,溫州 325000;

2.溫州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,溫州 325000

2011-01-18;

2011-04-23