張小娟，張榮光，段廣才，范青堂

2.鄭州大學(xué)河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州450001

幽門螺桿菌抗原基因ureB在乳酸菌中的克隆表達(dá)與免疫反應(yīng)性研究

張小娟1，張榮光2，段廣才2，范青堂2

目的 為了開發(fā)幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）口服疫苗，將Hp尿素酶B（UreB）在食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900菌株中進(jìn)行表達(dá)，并研究其免疫反應(yīng)性。方法 PCR擴(kuò)增HpMEL－HP27菌株ureB基因（基因號(hào)：FJ436980），將其克隆入大腸桿菌－乳酸乳球菌穿梭質(zhì)粒pNZ8110中并轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ3900；采用正交試驗(yàn)確定目的蛋白表達(dá)的適宜條件；應(yīng)用western－blot鑒定其免疫反應(yīng)性。結(jié)果 成功擴(kuò)增了HpMEL－HP27菌株ureB基因，構(gòu)建了ureB基因的乳酸菌NICE（Nisin－controlled expression）原核表達(dá)系統(tǒng)；UreB蛋白適宜的表達(dá)條件為：在ureB重組菌生長至對(duì)數(shù)生長前期（OD600≈0.3～0.4）加入終濃度為40ng/mL的nisin，誘導(dǎo)表達(dá)5h，可溶性UreB蛋白表達(dá)量最高，可達(dá)27.26μg/mL培養(yǎng)基。可溶性UreB蛋白的表達(dá)占上清蛋白的比例最高可達(dá)20.19%；Western－blot結(jié)果顯示乳酸乳球菌表達(dá)的UreB抗原蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。結(jié)論 結(jié)果提示應(yīng)用乳酸乳球菌構(gòu)建幽門螺桿菌食品級(jí)疫苗可能具有較好前景。

幽門螺桿菌；乳酸乳球菌；NICE；UreB

2.鄭州大學(xué)河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州450001

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種革蘭氏陰性螺旋桿菌，能夠?qū)е挛秆?、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤和胃癌［1－3］。1994年，Hp被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為Ⅰ類致癌原。此外，Hp還與糖尿病、冠心病、血小板減少性紫癜等一些腸道外疾病有重要關(guān)系［4－6］。目前Hp感染的主要治療方案是聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑和抗生素的三聯(lián)療法，殺滅細(xì)菌效率超過90%。但是，這種治療方案仍存在以下問題：藥物療法副作用較多，如口腔異味、腹痛、惡心、嘔吐等；抗生素耐藥菌株的不斷增多；對(duì)于發(fā)展中國家感染人群來說治療費(fèi)用相對(duì)昂貴等［7－8］。免疫接種有望成為預(yù)防Hp感染最有效最經(jīng)濟(jì)的方法。

乳酸乳球菌（Lactococcuslactis，L.lactis）是一種革蘭氏陽性非致病性食品級(jí)細(xì)菌，通常被認(rèn)為是安全的（Generallyrecognizedassafe，GRAS），已經(jīng)在乳制品發(fā)酵工業(yè)方面應(yīng)用上千年。由于其基因可獲得性和易操作性，乳酸乳球菌已經(jīng)被廣泛用作外源蛋白表達(dá)的活菌載體。多個(gè)研究小組報(bào)告了用乳酸乳球菌表達(dá)細(xì)菌或病毒抗原基因，如：布魯氏桿菌L7/L12抗原，破傷風(fēng)毒素C片段，白細(xì)胞介素2等［9－11］。為了開發(fā)幽門螺桿菌的食品級(jí)口服疫苗，本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增了HpMEL－HP27ureB基因。有文獻(xiàn)報(bào)道，翻譯融合表達(dá)較轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)具有更高的表達(dá)活性［12］。為構(gòu)建ureB基因的翻譯融合表達(dá)系統(tǒng)，利用nisA啟動(dòng)子NcoⅠ酶切位點(diǎn)上的ATG作為起始密碼子，使插入的目的基因與啟動(dòng)子nisA的SD（核糖體結(jié)合位點(diǎn)）區(qū)構(gòu)成翻譯融合，為進(jìn)一步的抗原基因高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)，故在引物設(shè)計(jì)中在上游引物中引入6個(gè)堿基atgggc。將經(jīng)過菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后的ureB基因克隆入乳酸乳球菌NZ3900菌株構(gòu)建工程菌株NZ3900/pNZ8110－ureB，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并鑒定其免疫反應(yīng)性。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 MEL－HP27菌株為本教研室保存，分離自鄭州慢性淺表型萎縮性胃炎病人。乳酸乳球菌NZ3900菌株和質(zhì)粒pNZ8110購自荷蘭NIZO食品研究所。重組工程菌株TB1/pMAL－c2X－ureB為代麗萍博士構(gòu)建。大腸桿菌 MC1061為中國疾病預(yù)防控制傳染病所闞彪博士惠贈(zèng)。

1.2 菌株生長條件 乳酸乳球菌NZ3900生長在添加0.5% 葡萄糖的M17培養(yǎng)基中，30℃靜止培養(yǎng)。大腸桿菌MC1061生長在LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)。

1.3 主要儀器和試劑 臺(tái)式高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）；U－2001型紫外可見分光光度計(jì)（日本HITACHI公司）；溫度梯度基因擴(kuò)增儀（德國Biomtre公司）；凝膠圖像分析儀（美國Syngene公司）；超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）。PrimeStarTM HS DNA polymerase、T4DNA連接酶及核酸限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；凝膠回收試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司；M17培養(yǎng)基購自美國Difco公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增ureB基因 基因擴(kuò)增引物由北京賽百 盛 公 司 合 成，上 游 引 物 （P1）：5’－catgccatgggcatgaaaaagattagcag－3’（NcoI）；下游引物（P2）：5’－cgctctagactagaaaatgctaaagag－3’（XbaI）。引 物中下劃線部分為酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1716bp。PCR 循環(huán)條件：95℃ 5min；94℃ 1min，55℃1min，72℃3min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。1.5 構(gòu)建 NZ3900/pNZ8110－ureB重組子ureB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NcoI和與XbaI雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切的pNZ8110進(jìn)行過夜連接，然后用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于含有10μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)約40h，挑取單菌落液體培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行測序鑒定。經(jīng)過鑒定后的pNZ8110－ureB重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化乳酸菌NZ3900。

1.6 正交試驗(yàn)法優(yōu)化表達(dá)UreB 應(yīng)用誘導(dǎo)劑Nisin誘導(dǎo)UreB蛋白在乳酸菌重組子中的表達(dá)。正交試驗(yàn)采用L25（56）正交表，取 A（誘導(dǎo)劑濃度）、B（誘導(dǎo)時(shí)機(jī)）、C（誘導(dǎo)時(shí)間）3個(gè)因素。A因素取20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL共5個(gè)水平，B因素取菌液OD600約0.10～0.15、0.15～0.20、0.20～0.30、0.30～0.40、0.40～0.60共5個(gè)水平，C因素取誘導(dǎo)1h、2h、3h、4h、5h共5個(gè)水平，對(duì)UreB蛋白在乳酸菌重組子中的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 小鼠抗血清制備 取活化的TB1/pMAL－c2X－ureB工程菌種子，以1%比例接種于200mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)2h至 OD600約為0.40～0.50時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG終濃度至0.3mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h。超聲破碎離心取上清，直鏈淀粉樹脂親和層析柱分離純化MBP－UreB融合蛋白。調(diào)整純化 MBP－UreB融合蛋白濃度為0.2μg/μL后與等體積弗氏完全佐劑混勻進(jìn)行超聲乳化制備初次免疫抗原，于第1周對(duì)昆明小鼠進(jìn)行初次免疫，每只小鼠兩只后腿和腹腔注射200μL初次免疫抗原。將濃度為0.2μg/μL的純化 MBP－UreB融合蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻進(jìn)行超聲乳化制備加強(qiáng)免疫抗原，于第2周、第3周、第4周以同樣的方式注射加強(qiáng)免疫抗原各1次。最后1次免疫后1周，摘眼球取血，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆??？贵w滴度應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定。

1.8 乳酸乳球菌工程菌表達(dá)的UreB蛋白免疫反應(yīng)性研究 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)UreB蛋白的乳酸乳球菌工程菌超聲破碎后取上清進(jìn)行12%SDS－PAGE凝膠電泳，用Bio－Rad半干式電轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)膜，電壓20V，電轉(zhuǎn)40min。封閉后將NC膜置于用封閉液1∶100稀釋的小鼠抗血清中，37℃輕搖孵育1～2h。PBS和TBST各洗3次后將膜置于用含5% （W/V）脫脂奶粉的TBS稀釋的第二抗體中，37℃作用1～2h，TBST洗3次，每次10min。然后將膜放入平皿中，加入1mL新鮮配置的增強(qiáng)型辣根過氧化物酶標(biāo)記的DAB顯色液，輕輕振搖，直至顯色充分，用去離水漂洗，終止顯色，將膜轉(zhuǎn)入PBS中，照相保存。

2 結(jié) 果

2.1ureB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取 MELHP27菌株的染色體DNA后，應(yīng)用高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增ureB基因片段，PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出長度為1 716bp的ureB特異性片段（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增ureB基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Polymerase chain reaction （PCR）products of the MEL－Hp27ureB gene.

2.2ureB基因的序列測定結(jié)果ureB基因的序列測定結(jié)果經(jīng)過與GenBank上公布的Hp－MEL27ureB基因進(jìn)行BLAST比對(duì)，除了添加的的atgggc 6個(gè)堿基（加下劃線部分）外，基因序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)pMD19－T－ureB重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

2.3 菌液PCR鑒定 MC1061/pNZ8110－ureB重組子 從轉(zhuǎn)化板上挑取單菌落過夜搖菌后，50μL PCR反應(yīng)體系取5μL菌液為模板，以P1、P2引物做特異PCR鑒定，擴(kuò)增出1 716bp片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。

2.4 質(zhì)粒雙酶切鑒定 MC1061/pNZ8110－ureB重組子 取經(jīng)過菌液PCR鑒定為陽性的MC1061/pNZ8110－ureB重組子單菌落增菌液，堿裂解法抽提質(zhì)粒，用XbaⅠ單酶切和NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切進(jìn)行酶切鑒定。酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖電泳。結(jié)果顯示：單酶切產(chǎn)物片段長度和雙酶切產(chǎn)物片段長度均與預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí) MC1061/pNZ8110－ureB重組子構(gòu)建成功（圖4）。

圖4 質(zhì)粒雙酶切鑒定MC1061/pNZ8110－ureB重組子Fig.4 Identification of the recombinant MC1061/pNZ8110－ureBby restriction enzyme digestion.

2.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化UreB表達(dá) 經(jīng)過對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間3個(gè)因素及其5個(gè)不同水平進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，得出了UreB蛋白適宜的表達(dá)條件：在ureB重組菌生長至對(duì)數(shù)生長前期（OD600≈0.3～0.4）加入終濃度為40ng/mL的nisin，誘導(dǎo)表達(dá)5h，可溶性 UreB蛋白最高可達(dá)27.26μg/mL培養(yǎng)基。可溶性UreB蛋白的表達(dá)占上清蛋白的比例最高可達(dá)20.19%。

2.6 小鼠抗血清滴度ELISA測定結(jié)果 鼠抗UreB免疫血清以1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400稀釋后，與稀釋至20μg/mL的MBP－UreB融合蛋白進(jìn)行抗體效價(jià)的測定，并以正常小鼠血清作為陰性對(duì)照，結(jié)果血清抗體效價(jià)為1∶800，說明制備的小鼠抗UreB免疫血清具有良好的免疫反應(yīng)性。

2.7 乳酸菌表達(dá)UreB蛋白免疫反應(yīng)性研究 經(jīng)誘導(dǎo)的 NZ3900/pNZ8110－ureB工程菌超聲破碎后，離心取上清行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后 Western－blot鑒定乳酸菌表達(dá)UreB蛋白的免疫反應(yīng)性。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)表達(dá)工程菌各孔均出現(xiàn)預(yù)期蛋白分子量大小為61.859kD條帶，而對(duì)照空菌NZ3900無對(duì)應(yīng)條帶（圖5）。

3 討 論

Hp是流行最廣泛的人類病原體，全世界約有半數(shù)人口感染。由于疫苗被認(rèn)為是防止Hp感染最經(jīng)濟(jì)有效的方法，尤其是在發(fā)展中國家，因此近年來Hp疫苗的研究成為熱點(diǎn)。

圖5 乳酸菌表達(dá)UreB蛋白免疫反應(yīng)性Western－blot鑒定結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of UreB expressed by Lactococcus lactis transformant with polyclonal anti－UreB serum.

乳酸菌是一種革蘭氏陽性食品級(jí)細(xì)菌，長期以來廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)以生產(chǎn)發(fā)酵乳制品。由于乳酸菌是食品級(jí)微生物，其細(xì)胞組分或產(chǎn)生的酶可以部分純化或不需純化，而直接使用其天然的細(xì)胞提取物。以乳酸菌作為活菌疫苗載體在Hp的疫苗研制方面也有應(yīng)用。孫振璐［13］等在乳酸菌中表達(dá)幽門螺桿菌（Hp）黏附素alpA基因，并口服免疫小鼠后檢測其免疫原性。結(jié)果顯示：表達(dá)alpA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異的IgG和IgA，可作為幽門螺桿菌口服疫苗候選抗原，為乳酸菌作為抗原遞送載體的研究和Hp口服疫苗的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Gong［14］等應(yīng)用乳酸菌MG1363作為疫苗載體表達(dá)HspA，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以研究其免疫預(yù)防作用。將hspA基因克隆入pMG36e質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MG1363，表達(dá)的相對(duì)分子量為13kD的HspA蛋白可以被HspA抗體血清識(shí)別。Kim［15］等應(yīng)用乳酸菌 MG1363作為疫苗載體表達(dá)HpCag12外膜蛋白以研究其口服免疫誘導(dǎo)系統(tǒng)抗Cag12免疫反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：口服免疫表達(dá)Cag12外膜蛋白的轉(zhuǎn)化乳酸菌MG1363可以誘導(dǎo)系統(tǒng)的抗Cag12體液免疫反應(yīng)，這提示表達(dá)Cag12外膜蛋白的重組乳酸菌有可能通過口服免疫有效誘導(dǎo)抗Hp的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

因此，本研究選用乳酸乳球菌NZ3900與原核表達(dá)質(zhì)粒pNZ8110組成NICE高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。為了得到較大量的目的蛋白，本研究構(gòu)建了ureB基因的翻譯融合表達(dá)系統(tǒng)，將ureB基因插入pNZ8110質(zhì)粒啟動(dòng)子nisA的SD下游，利用啟動(dòng)子上NcoⅠ酶切位點(diǎn)上的起始密碼子作為翻譯起始密碼子。并進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)對(duì)工程菌株NZ3900/pNZ8110－ureB的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定了目的蛋白表達(dá)的適宜條件為：在乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8110－ureB生長至OD600為0.3～0.4時(shí)加入40ng/mL的nisin誘導(dǎo)5h，可得到 UreB蛋白27.26μg/mL，較之以往報(bào)道外源蛋白在乳酸菌中的表達(dá)量有明顯提高［9，16］。Western－blot結(jié)果顯示乳酸菌表達(dá)的 UreB可被小鼠抗UreB免疫血清識(shí)別，說明乳酸菌表達(dá)的目的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步的動(dòng)物學(xué)免疫保護(hù)性研究的開展奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Expression ofHelicobacterpyloriureBgene inLactococcuslactisNZ3900and its immunoreactivity

ZHANG Xiao－juan，ZHANG Rong－guang，DUAN Guang－cai，F(xiàn)AN Qing－tang

（PathogenBiologyStaffRoom，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China）

To lay a foundation for the further study ofHplive oral vaccine，Hpurease subunit B（UreB）was expressed in a food－grade delivery vehicle，andLactococcuslactisNZ3900and its immunoreactivity was studied.The UreB gene was amplified from genome DNA ofH.pyloriMEL－Hp27（GenBank accession no.FJ436980）and then cloned into theE.coli－L.lactisshuttle vector pNZ8110and transformed intoE.coliMC1061.The positive recombinant plasmid was electro－transformed intoL.lactisNZ3900.The conditions of UreB expression in theL.lactistransformant were optimized by orthogonal experiment.Western blot was adopted to confirm whether the UreB expressed byL.lactistransformant had immunoreactivity.As a result，the recombinant engineering bacteria has been successfully constructed through DNA recombinant technique，which were identified by specific PCR and restriction enzyme digestion of recombinant plasmids.The 40ng/mL nisin was added into the medium and induced for 5hwhen the recombinant engineering bacteria grew to logarithmic growth phase（OD600≈0.3－0.4）.The maximum yield ofUreB was 27.26μg/ml of medium，and the maximum percentage ofUreBin cell extracts of theL.lactistransformant reached its peak at 20.19%.Western blot analysis showed that theUreB protein expressed byL.lactistransformant has favorable immunoreactivity.All these results make an appealing case for construction of the food－grade vaccine forHp.

Helicobacterpylori；Lactococcuslactis；NICE；UreB

R378

A

1002－2694（2011）10－0925－04

段廣才，Email：gcduan＠public.zz.ha.cn

1.河南科技大學(xué)病原生物學(xué)教研室，洛陽 471003；

2010－11－12；

2011－03－08