韋正吉，陳 強(qiáng)，嚴(yán)斯剛

（廣西柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545005）

高致病性豬藍(lán)耳?。℉P-PRRS）經(jīng)過(guò)2006—2007年的全國(guó)大流行后[1-5]，在2008—2009年較為平穩(wěn)，僅出現(xiàn)零星散發(fā)。2009年年底在河南、湖北和山東等省出現(xiàn)了較大范圍的高致病性豬藍(lán)耳病流行。2010年4月份開(kāi)始在福建、廣東和廣西等南方省份部分養(yǎng)豬密集的區(qū)域出現(xiàn)了高致病性豬藍(lán)耳病的疫情，其中有些豬場(chǎng)發(fā)病非常嚴(yán)重，造成了較大的損失。主要表現(xiàn)為母豬發(fā)燒、停食、懷孕母豬大范圍流產(chǎn)、母豬或生長(zhǎng)肥育豬有較高的死亡率，產(chǎn)房小豬和保育豬死亡率較高，可達(dá)到80%甚至100%。

藍(lán)耳病病毒經(jīng)過(guò)幾年的演化變異后，在臨床上出現(xiàn)了新毒株的流行趨勢(shì)，病毒基因是否又出現(xiàn)了新的特點(diǎn)。為弄清這次流行病的病原特點(diǎn)，我們從本地檢測(cè)的PRRSV陽(yáng)性病料進(jìn)行了NSP2和ORF5基因的序列測(cè)定及分析，以為柳州本地預(yù)防和控制豬繁殖與呼吸綜合癥提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株

對(duì)2010年6—9月臨床送檢的疑似豬藍(lán)耳病病料經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)[6]，選擇2份陽(yáng)性病料作為豬繁殖與呼吸綜合征病毒測(cè)序的模板，病料編號(hào)為L(zhǎng)Z5和LZ6；PRRSV疫苗毒株（CH-1R株）購(gòu)自上海海利生物藥品有限公司。

1.2 主要試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；rTaq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、RNA 酶抑制劑、dNTP（10 mmol/μL）、隨機(jī)引物（9mer）和 DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自東盛生物公司；限制性內(nèi)切酶和pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌（E.coli）DH5α為廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院惠贈(zèng)。

1.3 引物的選擇與合成

根據(jù)GenBank中豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的基因序列及有關(guān)文獻(xiàn)[1，7]設(shè)計(jì)針對(duì)NSP2和ORF5基因的引物。引物序列如下：NSP2-F1：5'-CAA CAC CCA GGC GAC TTC AGA AAT G-3'；NSP2-R1：5'-CCA AGT CAG CAT GTC AAC CCT ATC-3'，所擴(kuò)增的片段理論大小約為796bp。ORF5-F1：5'-CTG AGA CCA TGA GGT GGG CAA CT-3'；ORF5-R1：5'-CAT CACTGGCGT GTA GGT AAT AGA AAA C-3'，所擴(kuò)增的片段理論大小約為748 bp。引物委托寶生物工程（大連）有限公司合成。引物合成后，稀釋至25 pmol/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒核酸抽提

PRRSV的總RNA根據(jù)UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行提取，抽提所得的總RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 cDNA第一鏈的合成

將抽提所得的總RNA進(jìn)行cDNA的合成，RT反應(yīng)條件：采用25μL的cDNA合成體系，即于0.2 mL反應(yīng)管中，PRRSV的RNA樣品各15.5μL，分別加入5×RT Buffer 5μL，Random 9mers（50pmol/μL）1μL，dNTP Mixture（10mmol/μL each）2 μL，Rnase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase XL（5U/μL）1μL，置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成，以25 ℃10 min，42℃ 60 min，96℃ 2 min的程序進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，結(jié)束cDNA合成后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 NSP2和ORF5基因的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)均采用25.0μL的反應(yīng)體系，即10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶 0.3μL、引物各 1.0μL、模板 2.0μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25.0μL。經(jīng)反復(fù)篩選，NSP2基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)最優(yōu)條件為：95℃預(yù)變性5 min；然后 94 ℃ 1 min、59 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。ORF5基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)最優(yōu)條件為：95℃預(yù)變性5 min；然后94℃1 min、56℃ 50 s、72℃ 1 min，進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.7 DNA回收與純化

PCR產(chǎn)物的純化，采用凝膠電泳切膠回收。用DNA凝膠回收試劑盒（東盛生物）回收電泳PCR產(chǎn)物50μL，經(jīng)回收后溶解于30μL無(wú)菌雙蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 連接、轉(zhuǎn)化、克隆及基因測(cè)序

將RT-PCR擴(kuò)增片段純化回收后，按pMD18-T載體說(shuō)明書，分別將目的基因連接入pMD18-T載體中，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選白斑，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。每個(gè)毒株挑選五個(gè)克隆搖菌，用堿裂解法提取質(zhì)粒，以PCR法及酶切法鑒定篩選陽(yáng)性重組子，并由寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的RT-PCR

用所設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增NSP2和ORF5基因，分別獲得與預(yù)期片段大小相符的特異性片段。所選的陽(yáng)性樣品LZ5、LZ6能擴(kuò)出NSP2基因大小約為796 bp的片段，擴(kuò)出ORF5基因大小約為748 bp的片段，均與預(yù)期相吻合（圖1、2）。

2.2 NSP2和ORF5基因cDNA的克隆及鑒定

NSP2和ORF5基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別插入pMD18-T載體的外源基因插入位點(diǎn)。挑取轉(zhuǎn)化DH5α后的單菌落（白斑）進(jìn)行培養(yǎng)，直接以培養(yǎng)的菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定，分別擴(kuò)增出NSP2基因（約796 bp）和ORF5基因（約748 bp）目的片段。所選的PCR陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，都出現(xiàn)預(yù)期的目的片段。

2.3 NSP2和ORF5基因序列的測(cè)定

選2個(gè)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，獲得LZ5、LZ6株目的基因片段核苷酸序列，部分NSP2基因序列長(zhǎng)均為796bp，含ORF5基因序列長(zhǎng)均為749 bp。通過(guò)Blast分析表明兩者均為PRRSV基因序列。

表1 LZ5、LZ6與其它毒株之間的NSP2、ORF5核苷酸序列及氨基酸序列同源性

2.4 序列分析

運(yùn)用DNAStar分析軟件將所測(cè)得的柳州流行毒株LZ5、LZ6的部分NSP2基因、ORF5基因與已發(fā)表的VR2332株、LV株、CH-1a株、MLV株和國(guó)內(nèi)高致病性藍(lán)耳病代表性毒株HEB1、HUB2、JXA1及近年廣西分離的部分代表性毒株進(jìn)行核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較，結(jié)果見(jiàn)表1。LZ5與LZ6之間的NSP2和ORF5基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.7%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為100%和99.5% ；LZ5、LZ6的NSP2基因與近年國(guó)內(nèi)分離的高致病性藍(lán)耳病代表性毒株基因序列高度同源，具有完全一致的缺失特征，在NSP2基因的第483位和535~563位氨基酸發(fā)生缺失（圖3）。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用DNAstar軟件中的MegAlign功能，分別繪制柳州PRRSV流行株 LZ5、LZ6與國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)參考毒株及部分廣西代表性毒株NSP2和ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)ORF5基因氨基酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)，所比較的14個(gè)PRRSV毒株明顯分為兩個(gè)基因群（圖4）。歐洲型代表毒株LV與其它毒株距離都很遠(yuǎn)，為單獨(dú)一群。LZ5、LZ6和國(guó)內(nèi)分離株與國(guó)際美洲型代表株VR2332關(guān)系較近，共同構(gòu)成另一群，屬美洲型，該群分為兩個(gè)亞群：LZ5、LZ6 與 2006 年夏高熱病PRRSV的代表性毒株HEB1、HUB2、JXA1 及 近 年 廣西分離的高致病性藍(lán)耳病毒株構(gòu)成第一亞群；弱毒疫苗株MLV （RespPRRS/Repro）和 國(guó)內(nèi)第一分離株CH-1a與VR2332株構(gòu)成另一亞群。根據(jù)NSP2基因氨基酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)與ORF5的結(jié)果大體一致（圖 5），所變化的是 LZ5、LZ6和國(guó)內(nèi)近年分離的高致病性PRRSV與CH-1a株遺傳距離相對(duì)較近，共同構(gòu)成美洲型（群） 的第一亞群，MLV和VR2332株則構(gòu)成另一亞群。遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)合核苷酸及氨基酸序列同源性可以看出：LZ5、LZ6與近幾年分離流行的高致病性藍(lán)耳病毒株基因序列高度同源，與2006年夏高熱病引起的PRRSV相比基因序列并未顯示出新的特性，很有可能均是由國(guó)內(nèi)第一分離株CH-1a變異進(jìn)化而來(lái)。

3 討論

3.1 根據(jù)DNAStar軟件分析，本試驗(yàn)研究擴(kuò)增的LZ5、LZ6株NSP2基因發(fā)生30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，具有與近幾年國(guó)內(nèi)分離的高致病性藍(lán)耳病代表性毒株（HEB1、HUB2和JXA1）完全一致的基因序列缺失特征。結(jié)合臨床病理特征表明，LZ5、LZ6株為流行于我市的高致病性PRRSV。

3.2 本研究柳州分離株LZ5與LZ6之間的NSP2和ORF5基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.7% ，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為100%和99.5%；LZ5、LZ6與近年廣西分離的高致病性PRRSV的NSP2和ORF5基因核苷酸序列同源性分別為94.7%~95.7%和97.2%~98.0%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為92.0%~94.7%和94.5%~97.0%；與2006年夏高熱病PRRSV的代表性毒株（HEB1、HUB2和JXA1）基因核苷酸序列同源性分別為95.4%~96.2%和97.7%~98.0%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為94.3%~95.5%和96.0%~97.0%?；蛐蛄蟹治霰砻鳎琇Z5、LZ6與2006年夏高熱病引起的PRRSV基因序列高度同源，在基因序列上并未顯示出新的特性，也未出現(xiàn)明顯的地域差異性。

3.3 LZ5、LZ6株與歐洲型代表 LV株 NSP2和ORF5等位基因的氨基酸同源性分別為18.9%和59.7%，與美洲型代表VR2332株等位氨基酸同源性分別為68.7%和86.5%（或 86.0%），故 LZ5、LZ6屬美洲型毒株，這與氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)劃分的基因歸屬結(jié)果一致。

3.4 遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，LZ5、LZ6和近年分離的高致病性PRRSV與疫苗株MLV（RespPRRS/Repro）雖然同歸屬于美洲型（群），但確歸屬于不同的亞型。LZ5、LZ6與MLV的NSP2和ORF5等位氨基酸同源性分別為68.7%和86.0%（或85.5%），基因變異較大。結(jié)果表明柳州本地PRRSV野毒正向遠(yuǎn)離疫苗毒MLV的方向變異，提示在實(shí)際防疫中應(yīng)該選擇與當(dāng)?shù)亓餍卸局暝诳乖陨舷嚓P(guān)的種毒制備疫苗免疫是有效防控該病的關(guān)鍵。

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