王佳斌，艾江平

(三亞市人民醫(yī)院，海南三亞572000)

長期大劑量使用糖皮質激素的患者有可能出現(xiàn)激素性股骨頭壞死，這在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死原因中位居第一［1，2］。骨保護素(OPG)和破骨細胞分化因子(RANKL)作為破骨細胞分化和調(diào)節(jié)骨吸收的關鍵因子，可直接影響破骨細胞功效，是骨質吸收的共同通路［3，4］。基質金屬蛋白酶(MMP)及基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)主要影響機體各種組織的發(fā)育和修復。本研究觀察了長期應用糖皮質激素致股骨頭壞死患者骨組織中OPG、RANKL、MMP-1、MMP-2、TIMP的表達變化，探討糖皮質激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2009年1月～2010年3月在本院接受手術治療的自愿捐贈股骨頭骨組織及骨髓的股骨頸骨折患者29例(對照組)及長期應用糖皮質激素(大劑量糖皮質激素沖擊治療超過1周，發(fā)病時正在接受糖皮質激素治療超過3周或2 a內(nèi)接受糖皮質激素治療)致股骨頭壞死患者30例(研究組)。對照組男18例、女11例，年齡43～68歲。研究組男20例、女10例，年齡42～67歲，排除酒精性、減壓病等原因造成的股骨頭壞死。本研究經(jīng)本院倫理委員會討論后批準。

1．2 標本采集及處理 對照組用小刮匙收集術中取出的股骨頭松質骨，研究組小刮匙或骨穿針取股骨頭松質骨，置4%多聚甲醛溶液固定。從兩組患者大粗隆穿刺抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，采用貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞(BMSCs):骨髓液中加高糖DMEM培養(yǎng)液，離心后棄上清，收集細胞;按1×109/L的標準接種于含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);2 d后更換培養(yǎng)基，至培養(yǎng)第8～10天，收集BMSCs。

1．3 BMSCs中OPG、RANKL mRNA的檢測 采用RT-PCR技術。根據(jù)目的基因在Genbank中的己知序列，采用Primer5．0軟件自行設計引物，參照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，合成cDNA第1鏈，進行PCR。通過 ABIprism 7300SDS軟件計算 OPG、RANKL mRNA的相對表達量。

1．4 股骨頭松質骨中MMP-1、MMP-2、TIMP蛋白的檢測 采用免疫組化SABC法。骨組織石蠟切片，微波修復抗原，PBS沖洗。滴加正常山羊血清，封閉液，室溫20 min;滴加Ⅰ抗，4℃過夜后PBS沖洗;滴加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，PBS沖洗;滴加試劑SABC，PBS沖洗。DAB顯色，蒸餾水沖洗。蘇木素復染，鹽酸乙醇分化。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光學顯微鏡觀察。MMP-1、MMP-2、TIMP蛋白定位于骨細胞胞質和胞膜上，呈棕黃色顆粒;取其光學顯微鏡圖像，通過Image-Pro Plus7．0分析軟件對圖像進行分析，每張切片均采用5個圖像測定陽性表達產(chǎn)物的積分光密度值(IOD值)，取均值，IOD值越大表示陽性產(chǎn)物表達越強。

1．5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件。計量資料比較用t檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

研究組BMSCs的OPG mRNA相對表達量為0．43 ±0．12、RANKL mRNA 為 1．48 ±0．32，對照組分別為0．72 ±0．05、0．96 ±0．43，兩組相比，P 均＜0．05。研究組骨組織中 MMP-1、MMP-2、TIMP 蛋白的 IOD 值分別為 329．43 ± 75．54、324．53 ±65．53、68．32 ± 18．85，對照組分別為 189．42 ±25．58、145．43 ±25．76、275．23 ±48．43，兩組相比，P均 ＜0．05。

3 討論

在無菌性股骨頭壞死的病因中，最主要的因素為長期糖皮質激素的應用。糖皮質激素性股骨頭壞死的發(fā)病主要與血管內(nèi)凝血、脂質代謝紊亂、股骨頭內(nèi)高壓、基因表達異常及骨質疏松等有關。

RANKL主要由成骨細胞前體及成骨細胞表達，通過旁分泌方式與其受體結合，促進破骨細胞的生成和活化。OPG在骨組織中為RANKL的受體，能夠與RANKL結合，而阻止RANKL與RANK的結合，進而阻止了破骨細胞的生成和活化［5］。本研究結果顯示，研究組BMSCs的OPG mRNA較對照組降低、RANKL mRNA較對照組增高，這將有利于破骨細胞的生成及其活性的提高，使骨吸收加劇。這可能是激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制之一。

MMP及其特異性抑制因子TIMP參與降解各種組織細胞外基質。MMP-1、MMP-2是骨吸收過程中降解骨基質有機物成分(如Ⅰ型膠原)的主要蛋白酶。研究［6，7］表明，MMP-1、MMP-2 分泌增多和(或)TIMP分泌減少，將促進骨基質的降解。本研究結果顯示，與對照組相比，研究組骨組織中 MMP-1、MMP-2蛋白的表達明顯增強，而TIMP的表達則明顯減弱，這將會造成骨組織的破壞。這可能也是激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制之一。

總之，長期應用糖皮質激素導致的股骨頭缺血性壞死可能與OPG/RANKL、MMP/TIMP系統(tǒng)的平衡失調(diào)有關。糖皮質激素可能直接或間接破壞OPG/RANK、MMP/TIMP系統(tǒng)的平衡，上調(diào)破骨細胞活性，加速骨細胞凋亡和骨基質降解，促進骨吸收，導致股骨頭缺血性壞死;或通過導致骨質疏松癥，使股骨頭不能承受正常壓力負荷、局部凝血異常而缺血壞死［8］。

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