蔡英蘭，樸麗花，張默函，姜京植，金 政

(延邊大學基礎醫(yī)學院，吉林 延吉 133002)

糖尿病患者普遍存在胃腸功能紊亂，報道約75%的糖尿病患者有胃腸道癥狀，如腹脹、上腹不適、便秘等［1］，導致降糖藥吸收遲滯，血糖控制不良，還可能引起低血糖等。但糖尿病致胃腸動力紊亂的機理仍不完全清楚。胃腸道中存在鈉尿肽(NP)—鈉尿肽受體(NPR)-B/pGC-cGMP和 NO-sGC-cGMP兩種信號轉導途徑［2］，均參與胃腸動力調(diào)節(jié)。研究表明，胃腸道內(nèi) NP及NPR對豚鼠、大鼠和人胃平滑肌自發(fā)性運動均發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用［3，4］。本研究組前期研究證明，糖尿病胃動力障礙大鼠C型鈉尿肽(CNP)抑制胃竇平滑肌收縮的作用明顯增強［5］。我們于2009年12月～2010年5月進行本研究，擬繼續(xù)探討糖尿病胃動力障礙大鼠胃竇平滑肌對CNP敏感性增強的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量220～250 g，由延邊大學實驗管理科動物實驗中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma);CNP、NPR-B抗體(Santa Cruz);RM-6240多道生理信號記錄系統(tǒng)(中國成都儀器廠);TD-2000型真彩病理細胞顯微分析系統(tǒng)(北京天地百年科技有限責任公司)。

1.2 動物模型的制備 Wistar大鼠禁食12 h，自由飲水，腹腔注射STZ(65 mg/kg)制備糖尿病動物模型。正常對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。造模成功后大鼠均單籠飼養(yǎng)4周，自由進食、飲水。將大鼠擊頭致昏，沿中線剖腹取全胃，放入4℃氧飽和的 Kerb’s液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.75 mmol/L、CaCl22.54 mmol/L、KH2PO41.19 mmol/L、MgSO41.19 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，充以95%O2和5%CO2的混合氣體，pH 7.2～7.4)中，沿胃小彎側剪開，漂洗出胃內(nèi)容物。小心剪去黏膜層，在距幽門近口端5 mm處沿胃竇環(huán)行肌纖維走行方向剪取2 mm×12 mm的環(huán)行肌條。取下的肌條放置于Kerb’s液垂直灌流槽中，其一端固定在鉑絲鉤上，另一端與張力換能器相連，灌流槽內(nèi)溫度維持在37℃，并持續(xù)供給95%O2和5%CO2的混合氣體。每次實驗時均給予1 g前負荷，在氧飽和的Kerb’s液灌流槽中孵育40 min，待肌條自發(fā)性收縮穩(wěn)定后，通過RM-6240多道生理信號記錄系統(tǒng)同時記錄正常對照組和糖尿病組大鼠胃竇平滑肌收縮活動、肌條收縮運動的振幅和頻率。將收縮頻率明顯慢于正常的大鼠列入糖尿病胃動力障礙大鼠模型。

1.3 免疫組織化學方法 取胃竇部組織用4%甲醛緩沖液固定24 h。常規(guī)方法進行免疫組化實驗。兔CNP抗體1∶600稀釋，NPR-B抗體1∶600稀釋。觀察正常對照組及糖尿病組大鼠胃竇組織中CNP的分布。選取部分胃組織切片作為陰性對照(用PBS替代兔CNP抗體)，與其他切片在同一條件下進行染色。

1.4 實驗結果判定 兩組隨機抽取3張切片，每張切片隨機取3個視野，按胃竇平滑肌CNP及NPR-B顯色程度分弱、中、強3種，分別計1、2、3分，用TD-2000醫(yī)用真彩色圖像分析軟件計算相應范圍，將顯色程度和范圍換算成顯色指數(shù)。顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍。

2 結果

2.1 胃竇平滑肌CNP分布 正常對照組及糖尿病組大鼠胃竇組織均有CNP蛋白陽性表達，即可見棕色顆粒，主要見于肌層。正常對照組CNP蛋白顯色指數(shù)為(41.26±0.71)%，糖尿病組為(41.71±0.21)%，兩者CNP蛋白顯色指數(shù)比較無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)。

2.2 胃竇平滑肌NPR-B的分布 正常對照組胃竇平滑肌細胞NPR-B呈陽性，可觀察到散在分布的棕色顆粒，NPR-B蛋白顯色指數(shù)為(17.63±1.49)%;糖尿病組胃竇平滑肌細胞NPR-B也呈陽性，但與正常對照組相比呈陽性的棕色顆粒明顯增多、染色明顯加深，NPR-B蛋白顯色指數(shù)為(30.67±1.59)%。兩組NPR-B蛋白顯色指數(shù)比較P＜0.01。

3 討論

NP通過與細胞膜上的NPR結合而發(fā)揮生物學作用［6］。NPR 主要有 3種:NPR-A、NPR-B 和 NPRC，均屬于膜受體。CNP主要與NPR-B結合［7］。NP抑制胃平滑肌的作用機制主要是通過NP-NPR-B/pGC-cGMP信號轉導途徑，使Ca2+外流，膜電位超極化［5～7］。正常生理條件下 CNP作用強于 ANP和BNP，且糖尿病胃動力障礙大鼠胃竇平滑肌對CNP的敏感性顯著增強［5］。

糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中NP-NPR-B/pGC信號系統(tǒng)的改變起重要作用。Walther等［8］研究結果表明糖尿病小鼠心肌組織NPR-B信號增加，可導致心肌癥的發(fā)生、發(fā)展。Christoffersen等［9］報道糖尿病大鼠血管組織中ANP-NPR-A信號系統(tǒng)和CNPNPR-B信號系統(tǒng)上調(diào)，并阻止高血壓的發(fā)生、發(fā)展。此外，糖尿病大鼠腎組織ANP mRNA表達增強可能是為了參與適應糖尿病高糖高滲狀態(tài)［10］。這些結果提示糖尿病胃動力障礙大鼠胃組織中可能發(fā)生這些信號系統(tǒng)的改變。

本研究觀察到，CNP主要分布在胃竇平滑肌層，環(huán)行肌和縱行肌均有分布，并通過與平滑肌細胞膜上的NPR-B結合而發(fā)揮生理作用。腹腔注射STZ飼養(yǎng)4周的糖尿病組與正常對照組大鼠相比，胃竇平滑肌組織中CNP分布無明顯差異，而NPR-B在糖尿病組大鼠胃竇平滑肌中分布明顯增多。NPR-B上調(diào)可使胃竇平滑肌cGMP濃度增高，cGMP濃度增高勢必增強平滑肌的舒張作用，最終將導致胃動力障礙。以上結果提示，腹腔注射STZ飼養(yǎng)4周的糖尿病胃動力障礙大鼠胃中CNP-NPR-B/pGC-cGMP轉導系統(tǒng)起重要作用，其中NPR-B上調(diào)可能發(fā)揮關鍵作用。

［1］Zhao J，F(xiàn)r?kjaer JB，Drewes AM，et al.Upper gastrointestinal sensory-motor dysfunction in diabetes mellitus［J］.World J of Gastroenterol，2006，12(18):2846-2857.

［2］Toda N，Herman AG.Gastrointestinal function regulation by nitrergic efferent nerves［J］.Pharmacol Rev，2005，57(3):315-318.

［3］Guo HS，Cui X，Cui YG，et al.Inhibitory effect of C-type natri-uretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24(10):1021-1026.

［4］Guo HS，Cai ZX，Zheng HF，et al.Role of calcium-activated potassium currentin CNP-induced relaxation of gastric circular smooth muscle in guinea-pigs［J］.World J Gastroenterol，2003，9(9):2054-2059.

［5］Xu DY，Liu L，Cai YL，et al.Natriuretic peptide dependent cGMP signal pathway potentiated relaxation of gastric smooth muscle in streptozotocin-induced diabetic rats ［J］.Dig Dis Sci，2009，55(3):589-595.

［6］Potthast R，Potter LR.Phosphorylation-dependent regulation of the guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors［J］.Peptides，2005，26(6):1001-1008.

［7］Misono KS.Natriuretic peptide receptor:structure and signaling［J］.Mol Cell Biochem，2002，230(1-2):49-60.

［8］Walther T，Heringer-Walther S，Tsch?pe R，et al.Opposite regulation of brain and C-type natriuretic peptides in the steptozocin-diabetic cardiopathy［J］.J Mol Endocrinol，2000，24(3):391-395.

［9］Christoffersen C，Bartels ED，Nielsen LB.Heart specific up-regulation of genes for B-type and C-type natriuretic peptide receptors in diabetic mice［J］.Eur J Clin lnvest，2006，36(2):69-75.

［10］Yoshimoto T，Naruse M，Naruse K，et al.Vascular action of circulating and local natriuretic peptide systems is potentiated in obese/hyperglycemic and hypertensive rats［J］.Endocrinology，1996，137(12):5552-5557.