楊學智，張芝蓮

(陽煤集團總醫(yī)院，山西陽泉 045000)

眾所周知，病理診斷所應用的最早最經(jīng)典的技術(shù)是光學顯微鏡技術(shù)。但隨著生物醫(yī)學的不斷發(fā)展，光學顯微鏡技術(shù)的局限性逐漸顯露，已不能完全滿足臨床病理診斷的要求。近幾十年，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，帶動了分子病理學相應技術(shù)的建立，為病理診斷的發(fā)展提供了新的途徑［1］?，F(xiàn)將幾種生物新技術(shù)在病理診斷中的應用進展綜述如下。

1 免疫組織化學

免疫組織化學是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應來檢測和定位組織或細胞中的某種化學物質(zhì)的一門技術(shù)。其特點不僅有較高的敏感性和特異性，還可以將形態(tài)學改變與功能、代謝變化結(jié)合起來，直接在各種切片上定位某種物質(zhì)，并可結(jié)合電子計算機圖像分析系統(tǒng)或激光掃描共聚焦顯微術(shù)，對被檢物定量分析。目前，該技術(shù)已廣泛應用于臨床病理，已成為病理診斷中不可或缺的診斷方法。尤其在腫瘤病理診斷中，協(xié)助低分化腫瘤、疑難腫瘤的診斷及淋巴瘤的分型中發(fā)揮了極其重要的作用。此外在細胞增殖和凋亡的研究、激素受體和耐藥蛋白檢測方面也具有重要價值［2，3］。但實際工作中，由于影響免疫組化染色質(zhì)量的因素很多，可能造成判斷的失誤。因此，選擇質(zhì)量好的商品化抗體、嚴格技術(shù)操作和對照十分重要。

2 電子顯微鏡技術(shù)

由電子束和電子透鏡組合成的電子光學系統(tǒng)可以將微小物體放大成像，極大地提高了分辨率。目前最好的電鏡分辨率可達0.14 nm，有效放大倍數(shù)為100萬倍。電鏡可看清細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)的各種細胞器和細胞核的細微結(jié)構(gòu)及其病理變化，并由此產(chǎn)生了亞細胞結(jié)構(gòu)病理學［4］。電鏡技術(shù)的應用領域很寬，在臨床上可用于多種疾病亞細胞結(jié)構(gòu)病變的觀察和診斷，特別是腎小球疾病，以及一些疑難腫瘤的組織來源和細胞屬性判定，如一些去分化、低分化或多向分化腫瘤的診斷和鑒別診斷。電鏡技術(shù)也有其局限性，有時還可能遺漏信息，如當用于輔助腫瘤外檢時，只能判定組織或細胞來源，不能確定腫瘤的良惡性質(zhì)［5］。

3 原位多聚酶鏈式反應技術(shù)

原位PCR技術(shù)是將PCR的高效擴增與原位雜交的細胞及組織定位相結(jié)合，在冷凍或石蠟包埋組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測和定位核酸的技術(shù)［6］。該技術(shù)能用于低拷貝內(nèi)源性基因的檢測和定位，在完整的細胞樣本上能檢測出單一拷貝的DNA序列，可用于基因突變、基因重排和染色體易位等的研究和觀察。還可用于外源性基因的檢測和定位，如對各種感染性疾病病原(EB病毒、人乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒和人免疫缺陷病毒)的基因檢測。在臨床上還可用于對接受了基因治療患者體內(nèi)導入基因的檢測等。然而，該技術(shù)目前還難于在國內(nèi)大面積推廣使用，主要是由于其特異性不高、技術(shù)操作復雜、需特殊設備、價格昂貴等。但隨著技術(shù)的不斷完善，原位PCR必將促使病理學新發(fā)展階段的到來［7］。

4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)

激光掃描共聚焦顯微技術(shù)是近代生物醫(yī)學圖像分析儀器研究最重要的成就之一。它是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像，較傳統(tǒng)顯微鏡有著不可比擬的優(yōu)勢［8，9］。利用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)可以在細胞原位用特異的熒光標記探針標記出核酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受體等分子，實現(xiàn)上述分子的定位、定性及定量檢測，也可以觀察細胞及亞細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)不但可以對單標記或雙標記細胞及組織標本的共聚焦熒光進行定量分析，還可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒光標記結(jié)構(gòu)的總體圖像，以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。因此，可以用于觀察細胞、切片和一些表面不平的標本，同時可以做三維圖像重建和標記強度的半定量分析。除上述功能，它還具有對活細胞長時間觀察、細胞內(nèi)酸堿度及細胞離子的定量測定、熒光漂白恢復等等功能。因此，在未來的幾年內(nèi)，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)將是包括病理學在內(nèi)的醫(yī)學研究中十分有效和有使用價值的主要研究儀器之一［10］。

5 顯微切割術(shù)

顯微切割術(shù)是20世紀90年代發(fā)展起來的一門新技術(shù)。切割的組織切片可以是冰凍或石蠟包埋組織切片或細胞涂片。它能從組織切片或細胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個、幾十個同類細胞，甚至單個細胞，再進行有關(guān)的分子生物學方面的研究，如PCR，PCR－SSCP及比較基因組雜交等。此后，在此基礎上又發(fā)展起來激光捕獲顯微切割技術(shù)。它的基本原理是:將組織切片放在倒置顯微鏡的載物臺上，并在切片表面覆蓋一層乙烯乙酸乙烯酯(EVA)薄膜，激光束從上方垂直照射下來，光斑正好落在要切割的區(qū)域。該區(qū)的EVA膜受激光照射后，瞬間溫度升高并與其下的細胞相粘連，但不損傷細胞;當將EVA膜揭起來時，與之相連的細胞也隨之被完好地從切片上切割下來;將帶有細胞的EVA膜放入試管內(nèi)經(jīng)蛋白酶消化使細胞與膜分開，同時也將細胞裂解，獲得待提物質(zhì)，如DNA，RNA或蛋白質(zhì)。

顯微切割術(shù)尤其適用于腫瘤的分子生物學研究，如腫瘤的克隆性分析、腫瘤發(fā)生和演變過程中各階段細胞基因改變的比較研究和腫瘤細胞內(nèi)某些酶活性的定量檢測等。對顯微切割下來的霍奇金淋巴瘤的腫瘤細胞的免疫球蛋白受體基因重排，研究證實其有非胚系重排，即有B淋巴細胞的克隆性增生。該技術(shù)的不足使手工操作的技術(shù)難度增大;用顯微切割技術(shù)雖可克服上述不足，但需特殊設備，激光器造價又較高，還是限制了它的廣泛使用。

6 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是近年才發(fā)展起來的生物醫(yī)學高新技術(shù)系列，包括基因芯片、蛋白芯片和組織芯片。

基因芯片是固著在固相載體上的高密度DNA微點陣，又稱DNA芯片。，由美國斯坦福大學醫(yī)學中心生化系Brown教授領導的研究小組在1995年首先報道的。按功能可將其分為三類:即表達譜基因芯片、診斷芯片和檢測芯片，前者主要用于基因功能的研究;后兩者可用于遺傳病、代謝病和某些腫瘤的診斷和病原微生物的檢測等。利用基因芯片人們可以大規(guī)模、高通量地對成千上萬個基因同時進行研究，從而解決了傳統(tǒng)的核酸印記雜交技術(shù)操作復雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少和檢測效率低等問題。通過設計不同的探針陣列和使用特定的分析方法使該技術(shù)具有廣闊的應用前景［11］。

蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)微陣列，是對基因功能產(chǎn)物表達水平檢測的技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片也是在一個載體上點布密度不同種類的蛋白質(zhì)，再用熒光標記的已知抗體或配體與待測樣本中的抗體或配體一起同芯片上蛋白質(zhì)競爭結(jié)合，在掃描儀上讀出熒光強弱，再經(jīng)計算機分析計算出待測樣本結(jié)果。隨著蛋白質(zhì)芯片制作技術(shù)的不斷完善，檢測容量已達13 000多個點，并實現(xiàn)了整個過程全自動化檢測，具有高效率、低成本的特點，尤其適合于蛋白表達的大規(guī)模、多種類篩查，并能用于受體－配體、多種感染因素的篩查和腫瘤的診斷。

組織芯片是將數(shù)十個至數(shù)百個小的組織塊整齊地排列在某一載體上而成的微縮組織切片。其特點是體積小、信息含量大，并可根據(jù)不同的需求進行組合并制成各種組織芯片，能高效、快速和低消耗地進行各種原位組織學的研究和觀察，如形態(tài)學、免疫組織化學、原位雜交和原位PCR等，并有較好的內(nèi)對照及試驗條件的可比性［12］。

除上述技術(shù)外，其他一些近幾年才發(fā)展起來的生物醫(yī)學高新技術(shù)如流式細胞技術(shù)、比較基因組雜交等也在病理學中得到了應用，在此暫不贅述。這些新技術(shù)的發(fā)展和應用必將促進病理學診斷的進一步發(fā)展。

［1］ 查錫良，主編.醫(yī)學分子生物學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.

［2］ 武忠弼，主編.中華外科病理學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.

［3］ 朱梅剛，主編.惡性淋巴瘤病理診斷學［M］.廣州:廣東科技出版社，2003.

［4］ 王曉民，姜志國，王德文.生物醫(yī)學圖像信息技術(shù)的應用和發(fā)展［J］.中國體視學與圖像分析，2004，8(2):71-73.

［5］ 顏永碧，陸月良，王 英.電鏡技術(shù)在病理學診斷中的應用［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2003，6(24):628-649.

［6］ 蘇 偉，索振河.原位PCR技術(shù)［J］.國外醫(yī)學·遺傳學分冊，1996，19(2):64-66.

［7］ 李云家，宋運淳.原位PCR技術(shù)及其應用［J］.國外醫(yī)學·分子生物學分冊，1998，20(2):91-93.

［8］ Egger MD.The Development of Confocal Microscopy［J］.TINS，1989，12(1):11.

［9］ Huo Xia，Lu Jianxun，Yang Rendong，et al.Comparation of Laser Scanning Confocal Microscopy with Light Microsopy［J］.Acta Laser Biology Sinica，2001，10(1):76-79.

［10］ 李鵬云，曾曉榮.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)簡介［J］.瀘州醫(yī)學院學報，2006 ，29(5):469-470.

［11］ 張建中.DNA芯片技術(shù)及其在病理學研究中的應用前景［J］.臨床與試驗病理學雜志，2000，16(2):324-325.

［12］ Kononen J，Bubendorf L，Kallioniemi A，et al.Tissue Microarrays for High-Throughout Molecular Profiling of Tumor Specimens［J］.Nat Med，1998，4(3):844-847.