金 瀟，顏冬云，秦文秀

（青島大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,山東 青島 266071）

有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides，Ops）是一種在環(huán)境中廣泛使用的殺蟲(chóng)劑，具有高效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)，自20世紀(jì)60年代以來(lái)，逐漸取代了有機(jī)氯農(nóng)藥。

隨著有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用，其負(fù)面影響日益突出。殘存于作物、土壤或水體中的有機(jī)磷農(nóng)藥，經(jīng)物理遷移或化學(xué)轉(zhuǎn)化，最終通過(guò)食物鏈的傳遞和富集作用影響人類(lèi)及其他有益生物體[1]。1999~2001年，Abdel-Halim等[2]對(duì)一殺蟲(chóng)劑制造廠污水管道附近的污水、底泥和魚(yú)類(lèi)進(jìn)行采樣研究，結(jié)果表明，6份不同季節(jié)的樣品中均存在毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪農(nóng)、甲基嘧啶磷和溴丙磷。其中，毒死蜱在所有的水樣和底泥樣品中為主要污染物，濃度范圍分別為 24.5～303.8 ng/L、0.9～303.8 ng/L，二嗪農(nóng)在魚(yú)類(lèi)樣品中為主要污染物。

有機(jī)磷農(nóng)藥的降解方式主要分為生物降解、光化學(xué)降解、化學(xué)降解等3種，其中微生物降解具有操作簡(jiǎn)單、成本低、代謝繁殖快，對(duì)污染物氧化完全，不會(huì)產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。為此，本文綜述了有機(jī)磷農(nóng)藥微生物降解技術(shù)，以期為環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥的消解提供技術(shù)支撐。

1 降解菌種類(lèi)

目前，人們已分離出多種能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物菌群，其中包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌和一些藻類(lèi)。

由于細(xì)菌具有生化多適應(yīng)性及易誘發(fā)突變菌株等優(yōu)勢(shì)，故其在微生物降解中占有重要地位[6-7]。至今，已分離到的細(xì)菌主要有：假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬 （Baccillus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）、沙雷氏菌屬（Serratia sp.）等。金彬明等[8]從被有機(jī)磷污染的海水樣中分離篩選出一株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株，在28℃下對(duì)甲胺磷（5mg/L）的降解率達(dá)48.9%。解秀平等[9]從污水曝氣池中分離得到一株能以甲基對(duì)硫磷及其降解中間產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚為唯一碳源的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）菌株，在5 h內(nèi)對(duì)50mg/L的甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚的降解率分別為85%和98%。

真菌因其高效的降解能力正逐漸引起人們的重視，主要有：曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、酵母菌等。顏世雷等[10]通過(guò)長(zhǎng)期搖床馴化培養(yǎng)從污染土壤中篩選出兩株可在高濃度氧化樂(lè)果環(huán)境下生長(zhǎng)的曲霉菌株，在28℃時(shí)對(duì)氧化樂(lè)果的降解率分別為70.38%和61.28%。此外，某些藻類(lèi)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥也有一定的降解作用，如小球綠藻屬（Chorolla）能降解對(duì)硫磷、甲拌磷等[11]，但這方面的研究相對(duì)較少。

2 降解菌獲得途徑

目前，獲得可降解有機(jī)磷農(nóng)藥微生物的途徑主要有 3種，如下。（1）從受污染的土壤、水體底泥、污水處理廠出口的污泥等受污染的環(huán)境介質(zhì)中，進(jìn)行篩選、馴化、富集和分離。王華等[12]采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，從長(zhǎng)年施用樂(lè)果的土壤中分離篩選出一株能在高濃度樂(lè)果中生長(zhǎng)的，且以樂(lè)果為唯一碳源的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株，該菌株對(duì)樂(lè)果的平均降解量為1 306.33 mg/L·60 h。廖金英等[13]從土壤中分離篩選出兩株菌株，經(jīng)鑒定分別為頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）和糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）。在甲胺磷濃度為500 mg/L，30℃，180 r/min搖床上基質(zhì)培養(yǎng)72 h，對(duì)甲胺磷的降解率分別達(dá)到58.49%和65.80%。Zeinat等[14]從農(nóng)業(yè)廢水中分離篩選出5株以馬拉硫磷為唯一碳源和磷源的細(xì)菌菌株，經(jīng)鑒定，4株為產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），1株為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。其中，蘇云金芽孢桿菌在馬拉硫磷的液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，經(jīng)培養(yǎng)15 d后對(duì)馬拉硫磷的降解率達(dá)91%以上。（2）定向培育優(yōu)良菌種是近年來(lái)倍受關(guān)注的方法。該方法通過(guò)人為多次施藥，在土壤中培育可降解該農(nóng)藥的微生物。如，劉文海等[15]從被甲胺磷廢水污染的湖泊中分離細(xì)菌樣品，以甲胺磷為唯一碳源和能源，經(jīng)定向篩選，得到一株可高效降解甲胺磷的巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）菌株。氣相色譜測(cè)定結(jié)果表明，此菌株對(duì)甲胺磷的降解率在48 h和96 h分別為49.24%和98.20%。（3）利用化學(xué)誘變劑或其他誘變方法獲得新的降解菌。武曉煒等[16-17]通過(guò)紫外誘變育種從假單胞菌（Pseudomonas sp.）S-2中篩選出一株S-232。試驗(yàn)表明，S-232在30℃、搖床220 r/min的條件下，6d后，對(duì)甲胺磷的降解率達(dá)到74%，與菌株S-2的降解率相比，提高了8%～9%。

3 微生物降解機(jī)理研究

微生物對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解方式可分兩類(lèi)。

一類(lèi)是微生物直接作用于有機(jī)磷農(nóng)藥[18]，其實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng)，包括氧化、脫氫、還原、水解、合成等作用，主要是微生物本身含有可降解該農(nóng)藥的酶系基因?；蛘撸m然微生物本身并無(wú)可降解該有機(jī)磷農(nóng)藥的酶系[19]，但在農(nóng)藥脅迫下，微生物的基因發(fā)生重組或改變，產(chǎn)生了新的降解酶系。Mageong等[20]報(bào)道大腸桿菌產(chǎn)生的磷酸三酯酶能打開(kāi)P=S鍵。路楊等[21]分離出的菌株可以不同程度地打斷甲胺磷中的P=N鍵、P=O和P=S鍵，完全轉(zhuǎn)化為PO43-。阮少江[22]研究發(fā)現(xiàn)，甲胺磷經(jīng)甲胺脫氫酶（MADH）催化后，P=N鍵被打開(kāi)脫氨基，同時(shí)可檢出一定量的甲醇、PO43-和CH3SH。由此，他推測(cè)自然界中甲胺磷的降解很可能是從P=N的斷裂開(kāi)始的。對(duì)于微生物在其他種類(lèi)有機(jī)磷上的降解方式，有不同的報(bào)道。Liu等[23]在分離到的抗輻射不動(dòng)桿菌USTB-04降解甲基對(duì)硫磷的過(guò)程中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物。由此，他推測(cè)出USTB-04首先促使苯環(huán)上的C-C鍵發(fā)生斷裂而非作用于P=O鍵。

另一類(lèi)是微生物的活動(dòng)改變了微環(huán)境功能而間接促使農(nóng)藥降解。常見(jiàn)的作用方式有3種。（1）礦化作用。其指微生物直接以有機(jī)磷農(nóng)藥作為生長(zhǎng)基質(zhì)，將其完全分解成無(wú)機(jī)物如CO2和H2O等的過(guò)程。石利利等[24]研究了假單胞菌DLL-1在水溶液介質(zhì)中降解甲基對(duì)硫磷的性能、影響因素及其降解機(jī)理。結(jié)果表明，DLL-1菌能將甲基對(duì)硫磷完全轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)離子NO2-、NO3-，中間產(chǎn)物為對(duì)硝基苯酚。李曉慧[25]從長(zhǎng)期受毒死蜱污染的污水處理池中分離到一株毒死蜱高效降解菌株，該菌株能在24 h內(nèi)完全降解100mg/L的毒死蜱。（2）共代謝作用。其指微生物在有可利用碳源存在時(shí)，對(duì)原來(lái)不能利用的物質(zhì)進(jìn)行分解代謝的現(xiàn)象。艾濤等[26]分離到一株以共代謝方式降解樂(lè)果的真菌菌株L3，該菌株在120 h內(nèi)對(duì)樂(lè)果的降解率達(dá)29.2%。王永杰等[27]從污泥中分離出一株以共代謝方式降解樂(lè)果的菌株G1，對(duì)樂(lè)果的降解率達(dá)60%以上。（3）種間協(xié)同代謝。指同一環(huán)境中的幾種微生物聯(lián)合代謝某種有機(jī)磷農(nóng)藥。在這種情況下，培養(yǎng)混合菌是一種可行的解決辦法。對(duì)此，Douglas[28]曾做過(guò)嘗試性研究。

4 影響微生物降解的因素

溫度、pH值、農(nóng)藥初始濃度、微生物類(lèi)型、外加碳氮源等因素均會(huì)影響微生物對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解。

喬楠等[29]在研究廢水中樂(lè)果降解菌的篩選及作用條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，20~42℃，在一定pH值范圍內(nèi)，樂(lè)果都能被降解。其中，以pH值為7.0、30℃時(shí)的降解效果最好。此外，隨著pH值的升高，降解率下降。儀美芹等[30]分離到3株能以甲基對(duì)硫磷為碳源和能源的真菌，包括2株木霉菌（Trichodermasp.）和1株鏈格孢菌（Alternariasp.）。在30℃左右，3株真菌都生長(zhǎng)良好；低于10℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢，高于40℃生長(zhǎng)受到抑制；在pH值為7時(shí)，3菌株的降解率最高。此外，他們還發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥初始濃度對(duì)降解率有影響，菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥濃度有一定的適應(yīng)范圍。秦坤等[31]分離篩選出3株能降解樂(lè)斯本的真菌，分別為土生曲霉組（Aspergillus terreus）、長(zhǎng)梗串孢霉屬（Monilochaetes）和煙色曲霉組（Aspergillus fumigatus）。這3株真菌均能以樂(lè)斯本為唯一碳源，5 d內(nèi)對(duì)50 mg/L樂(lè)斯本的降解率分別達(dá)93.53%、91.37%、83.45%，且受初始濃度影響。隨著外加碳源濃度的升高，這3種真菌的生長(zhǎng)量都明顯增加，但降解率降低，生長(zhǎng)量與降解率不呈正相關(guān)關(guān)系。Anwar等[32]從污染土壤中篩選出一株高效降解毒死蜱及其代謝產(chǎn)物的短小芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus）菌株C2A1。研究發(fā)現(xiàn)，C2A1在不同pH值、接種濃度、外加碳源和營(yíng)養(yǎng)源以及毒死蜱不同濃度等培養(yǎng)條件下，菌株對(duì)毒死蜱的降解能力不同。吳春先[33]在探究環(huán)境條件和微生物對(duì)滅線(xiàn)磷降解的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著土壤含水量和溫度的增加，滅線(xiàn)磷的降解速度加快，微生物對(duì)滅線(xiàn)磷的降解效果受到顯著影響。在30℃、含水量為40%條件下，未滅菌土壤中滅線(xiàn)磷的半衰期為16.6 d，滅菌土壤中滅線(xiàn)磷的半衰期為31.6 d。有機(jī)質(zhì)對(duì)滅線(xiàn)磷的降解也有顯著影響，有機(jī)質(zhì)含量高，有利于滅線(xiàn)磷的降解。此外，滅線(xiàn)磷在堿性土壤中的降解速度比在酸性土壤中的快。30℃、含水量為40%的條件下，滅線(xiàn)磷在3種土壤中的降解速度依次為：東北黑土＞廣東紅土＞山東砂壤土。Zhao等[34]從長(zhǎng)期受甲胺磷污染的土壤中分離到一株真菌菌株ZHJ6草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），ZHJ6可以分別利用葡萄糖和甲胺磷為唯一碳源和氮源，還可以利用乙醇、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等為碳源和能源來(lái)降解甲胺磷。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，pH值5.0、25℃、1%的葡萄糖為菌株適宜降解條件。甲胺磷起始濃度為1.0×10-3mg/mL，培養(yǎng)12 d后，ZHJ6對(duì)甲胺磷的降解率達(dá)到99.9%。此外，ZHJ6在葡萄糖存在的條件下還可降解氧化樂(lè)果、辛硫磷、草甘磷，但不能降解毒死蜱、速滅磷、敵百蟲(chóng)、敵敵畏。因此，對(duì)其降解機(jī)理還有待深入研究。鄭永良等[35]從長(zhǎng)期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤中分離到一株降解菌HS-A32，能以甲胺磷作為唯一的碳源和氮源。HS-A32菌降解甲胺磷的最適溫度為30℃，最適pH值為7.0，最適降解濃度為1 000mg/L，降解率達(dá)82%。HS-A32菌能以多種碳、氮源生長(zhǎng)，外加可利用的碳源和氮源能促進(jìn)其對(duì)甲胺磷的降解。經(jīng)鑒定，HS-A32為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），該菌還能降解甲基對(duì)硫磷等多種有機(jī)磷農(nóng)藥。劉玉煥等[36]利用選擇性培養(yǎng)基從農(nóng)藥廠的廢水流經(jīng)地中分離到一株能高效降解樂(lè)果的絲狀真菌，經(jīng)鑒定為曲霉（Aspergillus），它能以樂(lè)果為唯一碳源和能源。在pH值7.0、30℃時(shí)，液體發(fā)酵120 h后，離心收集菌體處理的樂(lè)果，有機(jī)磷農(nóng)藥降解轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷的效率達(dá)87%，除Cu2+對(duì)菌株的降解率有促進(jìn)作用外，金屬絡(luò)合劑（鄰菲羅啉、聯(lián)吡啶和EDTA）和其它實(shí)驗(yàn)中的金屬離子如Ba2+、Al3+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Ag+、Hg2+、Fe3+、Cd2+、Li+對(duì)菌株的降解率有不同程度的抑制作用，對(duì)菌株的生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯的影響。此外，Cu2+對(duì)菌株的促進(jìn)作用有濃度限制。

微生物對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解受很多因素影響，且不同環(huán)境因素對(duì)微生物降解作用的影響差別很大。如何克服環(huán)境條件的影響，使微生物菌群對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解發(fā)揮最大效能，是未來(lái)研究時(shí)需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

5 微生物降解的廣譜性

眾多學(xué)者的研究表明，一種有機(jī)磷農(nóng)藥可以被多種微生物降解；同時(shí)，由于有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的相似性，一種微生物也可對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行降解，體現(xiàn)了微生物種類(lèi)的多樣性以及某些微生物功能的多樣性。

有機(jī)磷農(nóng)藥種類(lèi)繁多，在環(huán)境中往往不是單獨(dú)存在的，因此人們希望找到一種能廣譜性降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物菌群。江玉姬等[37]從農(nóng)藥廠附近的土壤中分離、篩選到一株能高效降解MP、辛硫磷、三唑磷和敵敵畏的玫瑰單胞菌屬細(xì)菌（Roseomonas），其對(duì) MP、辛硫磷、三唑磷和敵敵畏的降解率分別為96%、99%、98.9%、69.0%。Kazufumi等[38]研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)桿菌B-5可以降解異唑磷、二嗪農(nóng)、對(duì)硫磷、苯硫磷、殺螟硫磷、異柳磷、毒死蜱、滅線(xiàn)磷等多種有機(jī)磷農(nóng)藥，降解速率因底物不同而異。其中，B-5降解異唑磷的能力最強(qiáng)，1 h內(nèi)能完全降解濃度為10mg/L的異唑磷。劉玉煥等[36]采用富集、誘變分離方法成功獲得一株高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥樂(lè)果的真菌，它對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥的降解同樣有效，如甲胺磷、馬拉硫磷、對(duì)硫磷。這表明該菌株的降解特性具有廣譜性。Liu等[39]分離純化得到的青霉菌屬BP303能夠通過(guò)斷裂P=O和P=S鍵來(lái)降解多種有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，如甲基對(duì)硫磷、對(duì)氧磷、蠅毒磷、內(nèi)吸磷-s、亞胺硫磷和馬拉硫磷等。

6 降解酶的固定化技術(shù)

固定化技術(shù)是近些年來(lái)興起的一種對(duì)酶的處理技術(shù)，主要是應(yīng)用物理或化學(xué)的方法使酶與不溶于水的大分子載體結(jié)合。與普通的游離酶相比，固定化酶在保持原有酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，提高了穩(wěn)定性，可以多次使用，應(yīng)用前景廣闊。

目前，國(guó)內(nèi)外采用的酶固定化技術(shù)主要分為4種類(lèi)型：吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。郭軍等[40]采用一種新型的聚集體交聯(lián)酶固定化技術(shù)，對(duì)有機(jī)磷降解酶固定化酶的性質(zhì)和應(yīng)用形式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，有機(jī)磷降解酶固定化酶的半衰期在70℃時(shí)比游離酶提高2.1倍。該學(xué)者所采用的酶固定化技術(shù)成效顯著，有待深入分析。

7 基因工程菌的研究與應(yīng)用

近年來(lái)，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)始構(gòu)建具有超強(qiáng)降解能力的基因工程菌，強(qiáng)化有機(jī)磷的降解。Wang等[41]通過(guò)基因工程使有機(jī)磷水解酶（OPH）基因在一株煙草植物中得到表達(dá)。煙草植物細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上可以分泌出OPH并且對(duì)甲基對(duì)硫磷具有抗性。在培養(yǎng)14d之后，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)0.02%（v/v）甲基對(duì)硫磷的降解率達(dá)到99%。鄧敏捷等[42]從產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）中克隆出有機(jī)磷降解酶基因ophc2，將其在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并驗(yàn)證其生物學(xué)功能。酶學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)異丙基硫代β-D-半乳糖苷酶（IPTG）誘導(dǎo)4 h后，重組蛋白的酶活性是原菌的10倍。

8 結(jié)語(yǔ)

微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前主要研究成果是在實(shí)驗(yàn)室條件下完成的，其應(yīng)用推廣還有很大的局限性。未來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)應(yīng)主要集中在以下兩方面：篩選高效有機(jī)磷降解菌，并通過(guò)基因工程菌的構(gòu)建提高其降解效率；開(kāi)發(fā)降解酶制劑產(chǎn)品，使有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解技術(shù)得以商品化。

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