廖梅堅(jiān) 余裕強(qiáng) 朱良杰 孫家振 朱波 張學(xué)明

·實(shí)驗(yàn)研究·

小鼠睪丸組織中轉(zhuǎn)錄因子Elk1 cDNA的克隆

廖梅堅(jiān) 余裕強(qiáng) 朱良杰 孫家振 朱波 張學(xué)明

為了確定Ets家族轉(zhuǎn)錄因子Elk1在睪丸組織中有無(wú)表達(dá)，提取了正常小鼠睪丸組織的總RNA，經(jīng)RT-PCR、序列測(cè)定證實(shí)Elk1在正常小鼠睪丸組織中有表達(dá)，為進(jìn)一步探討其與睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

Elk1轉(zhuǎn)錄因子;睪丸;小鼠

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄調(diào)控需Ets相關(guān)分子(Ets related molecule，ERM)參與［1，2］。ERM是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，該家族至少包括11個(gè)亞家族、26個(gè)因子，廣泛參與多種細(xì)胞的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化等過(guò)程［3］。目前還不知道該家族其他分子在睪丸組織中是否表達(dá)。本研究旨在通過(guò)RT-PCR獲得該家族轉(zhuǎn)錄因子Elk1基因的部分編碼區(qū)，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，以確定其在正常睪丸組織中有無(wú)表達(dá)，為進(jìn)一步探討其與睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、材料 7～8周齡、體重30～35 g的成年雄性昆明白小鼠4只，頸椎脫臼法處死后取睪丸放入液氮，后移入-70°C冰箱保存。大腸桿菌DH5α株為本室保存，克隆載體pMD18-T、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase、Olig-dT、RNase抑制劑均購(gòu)自于Takara。DL2000、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒均購(gòu)自于北京Tiangen。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen，焦磷酸二乙酯(DEPC)、瓊脂糖均購(gòu)自Sigma，其他常用試劑購(gòu)自于長(zhǎng)春寶泰克。

1.2 引物設(shè)計(jì)［4，5］根據(jù)GenBank發(fā)表的Elk1的全序列設(shè)計(jì)合成特異性引物。Elk1的上、下游引物分別為:5'-CCTGAACTCTCCAGTTAGCC-3'，5'-CG TCTCCTACTTCAATGGTG-3'擴(kuò)增片段大小為191bp。

1.3 睪丸組織總RNA的提取及RT-PCR［4，5］參照試劑盒說(shuō)明，采用Trizol一步法提取睪丸組織總RNA，電泳檢測(cè)其完整性。采用常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94° C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，退火30 s(Elk1的退火溫度分別為58.2)，72°C延伸1 min，72°C擴(kuò)增10 min，循環(huán)數(shù)均為35個(gè)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。采用DNA片段凝膠回收試劑盒按說(shuō)明回收PCR產(chǎn)物。

1.5 克隆載體構(gòu)建及測(cè)序［4，5］將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體4℃下連接過(guò)夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Elk1，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、質(zhì)粒提取、PCR鑒定后，將陽(yáng)性菌液制成甘油菌，送北京英俊公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織總RNA提取及Elk1的PCR擴(kuò)增 將提取的總RNA凝膠電泳后在紫外燈下觀察，可以見(jiàn)到2條清晰的電泳條帶，分別為28S和18S，說(shuō)明RNA提取成功，無(wú)降解。Elk1的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后在紫外燈下觀察到一條大小在100-250bp間的清晰條帶，與預(yù)期目的帶大小191bp相符。

2.3 Elk1的序列測(cè)定 測(cè)序結(jié)果顯示，所獲Elk1 cDNA完全正確。表明本實(shí)驗(yàn)正確克隆了Elk1基因，與預(yù)期結(jié)果相符。

3 討論

Trizol一步法提取RNA避免了傳統(tǒng)提取方法的繁瑣過(guò)程和質(zhì)量不理想等問(wèn)題。為獲得高質(zhì)量的RNA，提取中所有用具均需RNA酶抑制劑DEPC處理，玻璃器皿180℃干烤8 h以上，提取前無(wú)菌操作間紫外照射2 h以上。操作中經(jīng)常更換手套，防止皮膚上帶有的RNA酶降解組織中的RNA。此外，還要注意內(nèi)源性RNA酶所造成的RNA降解。處死小鼠后應(yīng)迅速取睪丸并立即放入液氮。為保證RNA的提取率，同時(shí)也有利于下一步的RNA純化，取材量要大。加入Trizol后的反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，從而保證組織充分裂解。加大氯仿用量和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，離心后只取上層清液，這樣從睪丸組織中提取的總RNA回收率很高，質(zhì)量也較為理想。有了高質(zhì)量的總RNA，采用常規(guī)RT-PCR即可獲得目的基因cDNA，從電泳結(jié)果及序列分析結(jié)果看，所獲片段大小及核酸序列與預(yù)期完全一致。本結(jié)果為下一步利用熒光定量PCR、原位雜交等方法深入分析Elk1的表達(dá)量及準(zhǔn)確部位，揭示其與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生等的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

［1］Chen C，Ouyang W，Grigura V，Hassell JA，Chandrashekar V，Hofmann MC，et al.ERM is required for transcriptional control of the spermatogonial stem cell niche. Nature， 2005，436: 1030-1034.

［2］Schlesser HN，Simon L，Hofmann MC，Murphy KM，Murphy T，Hess RA，et al.Effects of PEA3(ets variant gene 5)on testis and body growth，time course of spermatogonial stem cell loss，and fertility in mice.Biol Reprod，2008，78:483-489.

［3］Gutierrez-Hartmann A，Duval DL，Bradford AP.ETS transcription factors in endocrine Systems.Trends Endocrinol Metab，2007，18 (4):150-158.

［4］F奧斯伯，R布倫特，RE金斯頓，等.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.嚴(yán)子穎，王海林，譯.北京:科學(xué)出版社，1998.

［5］J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版.金冬雁，黎孟楓，譯.北京:科學(xué)出版社，1995.

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào):30771555);吉林大學(xué)及吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2010B81157，200981SA14)

130062吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院

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