謝 敬 馮 鑫

（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

0 引言

目前人們生活的時代是史無前例的，人類基于可利用能源資源來談經濟發(fā)展。美國的政治經濟文章中也有相關報道，可持續(xù)利用資源已成為熱門話題。在過去，人類遭受周期性波動的石油危機上上下下已大致超過30年。研究者已經提出有關的經濟技術方法來克服石油進口依賴性，并依據強有力的科學根據來面臨此次挑戰(zhàn)。目前，與社會和經濟能源部門有關的全球環(huán)境問題已占國際議程的主要部分。很明顯可以看出，歸于石油經濟本身的生命周期，石油能源馬上就要走到盡頭。因此，預測并避免未來能源供應短缺問題，以及獲得新生物能源替代市場是非常重要的。

1 中國的能源問題

石油及其衍生物已經占領了經濟市場，對多種工業(yè)部分來說都是一種重要的商品，人們將它們轉化成產品以及服務來滿足需求。目前，中國正處在一個工業(yè)化的發(fā)展時期，石油需求量高速增長，我國原油消費量以年均5.77％的速度增加，而同期國內原油供應增速僅為1.67％，供需缺口逐年拉大。由于我國石油消費增長迅速，并受石油資源的限制，使中國對外依存度將進一步提高，石油供應中斷風險持續(xù)加大，安全形勢不容樂觀［1］。估計到2020年，中國石油消費量將達4.5～6.1億t，中國石油缺口量將達兩億多噸。同時，石油消耗的加速使我們面臨嚴重的氣候變化，并逐漸降低人們的生活環(huán)境質量。目前，全球能源消費79％來自化石能源、35％來自原油、23％來自天然氣、21％來自煤炭、9％來自水力和核能、12％來自木柴和風能以及太陽能，微生物也可幫助解決若干能源問題［2］，有關描述如下。

2 汽油與生物燃料乙醇

生物乙醇和其它生物燃料對于促進能源獨立和減少溫室氣體排放是極其重要的。有關可再生替代資源（如生物燃料）逐步代替石油的問題，在全球政治和經濟議程中存在很強的爭議［3］。作為生物燃料的生物乙醇與汽油的特性比較如下：⑴優(yōu)點：增加能源安全；提供一個有利的貿易平衡；極好的交通燃料；更清潔更有效的燃燒；高辛烷值；取代四乙基鉛作為辛烷值增加劑；其低揮發(fā)性降低了煙霧形成；降低了溫室氣體的排放；減少了微粒和有毒物質的排放；減少了臭氧前體的排放水平，避免空氣污染；對人類毒性低，不含硫；替代MTBE進行氧化。⑵缺點：只含有2/3能量；當與汽油混合超過總燃料的15％時，需修改發(fā)動機；無法通過管道運輸。

2.1 玉米生產乙醇

在國際市場上，生物乙醇主要由糖和玉米淀粉制得。20世紀80年代美國玉米生產生物乙醇就已經達到商業(yè)化，并有多個民營企業(yè)開始用玉米生產乙醇。自80年代初，燃料乙醇可以與汽油以任何比例混合使用。多年來，乙醇的生產量已經增加，在1979年產量只有378萬L，1987年3.4億蒲式耳玉米生產了32億L的無水乙醇，這滿足了人們3％的汽車燃料需求，2003年生產了106億L［4］，而在2007年生產量超過了227億L。

用玉米每年可產492億L乙醇，但隨著以玉米為原料產乙醇的進一步擴大，將導致糧食及食品價格猛漲，形成經濟危機。況且玉米制得的乙醇僅能滿足國家交通需求的2％。如果乙醇的需求量僅僅由玉米提供，那將要超出目前的玉米產量，并對糧食作物產生威脅。由于玉米的供應有限和基礎設施限制，導致生產能力不能無限的擴大，從而使玉米產乙醇量有一個上限。美國政府估計玉米產乙醇的量每年不會超過378～568億L［5］。因此，玉米并不能真正解決未來的能源問題。在將來，木質纖維生物質將會對不依賴化石能源提供一個平臺。

2.2 甘蔗生產乙醇

歷史上，巴西在可再生液體燃料方面是一個主導國家，在那兒人們用甘蔗生產乙醇。自90年代以來，此挑戰(zhàn)性項目可滿足90％新型轎車對純乙醇的需求，并可滿足對含20％～22％乙醇的混合汽油的需求。2005年期間，混合汽油乙醇含量提高到25％。巴西的可再生燃料進程在全世界一直是個很好的例子。在2003～2004作物年度，乙醇的產量達到143.8億L，這滿足了巴西國內40％的燃料消耗量［6］。其中乙醇價格是汽油的65％，并且副產物甘蔗渣可用于發(fā)電。

2.3 農林業(yè)木質纖維素生物質生產乙醇

由于沒有足夠的玉米生產乙醇，更多的乙醇產量來自生物質。有關可再生原料的問題，將生物燃料部門的視野從糧食和谷類作物轉移到非食品木質纖維素生物質上是非常重要的。另外，纖維素乙醇在能源平衡方面比玉米乙醇好5倍，并且生產生物質乙醇所需能量比其提供能量的10％還要低［7］。每年可用的生物質儲量約為1.8～2.0億t（t為干噸：扣除水分后的重量），以302L/t（干噸）的產量可生產出605.7億L的乙醇［8］。據美國農業(yè)部門和能源部門估計，農業(yè)和林業(yè)每年分別可產10億t和3億t生物質，這可生產出3028.3億L的生物能源，滿足了30％～40％的使用量，并且此需求可通過在農業(yè)和林業(yè)的土地利用上做相對適中的變化來實現(xiàn)。在亞洲，稻草可作為較好的基質產生物乙醇，其中稻草的成本（27美元/t）比石油的成本（340美元/t）少［9］，也比玉米和小麥（135美元/t）或糖（340美元/t）的成本少，并且稻草構成了世界農業(yè)量的一半，如果將它燃燒會引起健康和環(huán)境問題。

廢品中的木質纖維素是廉價的、大量的和可再生的。它是用于轉換燃料最豐富的可再生自然資源，它含有的纖維素和半纖維素成分可以轉化成低聚糖、己糖和戊糖與木質素，因此它們可以成為對自然資源合理利用的替代方案，即通過廉價的可再生原料來增加生物燃料的生產量，并能在產生較小的溫室效應下改善能量平衡。大量城市及工業(yè)廢品也有助于解決目前的污染問題，若纖維素生產乙醇成為現(xiàn)實，那么下一個重點將是這些廢料資源［10］。

與汽油相比，木質纖維素乙醇的溫室氣體排放量約減少80％，而玉米乙醇減少了20％～30％。生物能源作物可以轉化大氣中的CO2成為有機碳來平衡CO2排放物。農業(yè)殘余物是可持續(xù)的、大部分未經開發(fā)的、廉價的，它們包括葉、莖和花梗（但不包括果實和種子），這些資源來自玉米纖維、玉米秸稈、甘蔗渣、水稻殼、木本作物和森林中的殘留物等。同樣，有很多資源來自工農業(yè)生產過程中的廢料，如柑橘皮、木屑、紙漿、工業(yè)廢物、城市垃圾和造紙污泥。另外，用于生物燃料的專用能源作物還包括柳枝和多年草本植物（如芒草、百慕大群島草、象草等），它們具有以下優(yōu)點：理想的環(huán)境質量、可以有效的利用水資源、高作物產量（12.3t/ha，t為干噸）、防止水土流失、促進土壤肥力并且需要很少的化肥和殺蟲劑。研究表明柳枝轉化生物乙醇的五年田間試驗是非常成功的，并說明了多年生作物（如柳枝）比一年生作物（如玉米）更好［11］。相對于一年生作物，多年生作物需要更少的農業(yè)投入。同時，可計算出柳枝轉化乙醇得到的可再生資源比轉化過程中消耗的能源多500％以上，并且在溫室氣體排放上有明顯的優(yōu)點。

除了纖維素和半纖維素，另一個重要的生物質成分是木質素，它是一個復雜的芳香族聚合物，其中包括15％～25％的植物生物量和40％的能源，木質素作為發(fā)電（熱能和電力）的能源源泉（鍋爐燃料）具有相當?shù)臐摿?。木質素在分餾和轉化操作中作為一個副產品，它本身是一個可再生燃料，能排放最少的溫室氣體，因為它產生的CO2可以由生長的植物生物質吸收［12］。因此，木質素有足夠的能量帶動發(fā)酵過程并產生電力來出售。

另外最值得人們注意的是，相對于玉米生產乙醇，纖維素發(fā)酵過程中的生物質原料需要更先進的預處理，以便使纖維素、半纖維素和木質素的可發(fā)酵糖解鏈［13］。

2.4 纖維素水解過程中發(fā)酵糖解鏈的困難

木質纖維素很難被水解，是因為（1）與半纖維素結合（2）周圍環(huán)繞著木質素，使其與半纖維素共價結合（3）大部分具有晶體結構，有四個分子內氫鍵和兩個分子間氫鍵，擁有一個高度有序緊湊的結構［14］。因此為達到經濟效益，就需解開被木質素密封包圍的纖維素和半纖維素多聚糖中的可發(fā)酵糖。為了解構高度有序緊湊排列的晶體和無定形纖維素區(qū)，前處理技術是非常重要的，這有助于破壞結晶，去除木質素，增加孔容，并溶解纖維素和半纖維素，從而使目的聚合物容易受酶的作用。通過生物質預處理技術的協(xié)調發(fā)展努力，連續(xù)技術優(yōu)化是一個非?；钴S的領域，在進入微生物發(fā)酵階段前致力于提高發(fā)酵糖的總收率［15］。

3 生物乙醇的生產

3.1 酵母菌

糖或多糖（可解聚成發(fā)酵糖）發(fā)酵的主要代謝產物是乙醇，釀酒酵母可用于己糖發(fā)酵，而赤畢酵母或念球菌可用于戊糖發(fā)酵。在最佳條件下，釀酒酵母對糖發(fā)酵5d可產生10％～12％體積的乙醇，這種高濃度會減慢酵母的生長并使其停止發(fā)酵。對特殊的酵母菌，當酒精濃度為20％體積時發(fā)酵還可以繼續(xù)進行，不過這個濃度在發(fā)酵數(shù)月或數(shù)年后才可以達到。目前，所有含酒精的飲料都是由發(fā)酵制得，工業(yè)酒精主要是由發(fā)酵制得，但在石化工業(yè)中有一些仍是由乙烯制得。一份釀酒酵母發(fā)酵糖得乙醇的清單［16］如下：蔗糖96h內產量97g/L，甘蔗糖蜜30h內產量70g/L，甜菜蜜糖192h內產量53g/L。

為了提高酵母發(fā)酵生產乙醇的產量，研究者進行了很多基因操作。例如，消除3-磷酸甘油脫氫酶基因gdp1和過度表達谷氨酸合酶基因glt-1來增加釀酒酵母生產乙醇的產量，同時降低甘油、醋酸鹽和丙酮酸鹽的形成［17］。通過減少NADH并得到一個更易接受NAD+/NADH的比率，可進行glt-1基因的過度表達處理。另一項研究顯示，釀酒酵母中glt-1基因的過度表達和fps1基因的消除，會使葡萄糖發(fā)酵產乙醇的量從108g/L提高到123g/L［18］。Hahn-Hagerdal等［19］已對戊糖發(fā)酵的酵母菌進行研究，并對木糖發(fā)酵的P.stipitis的基因組序列進行了測序［20］。采用P.stipitis對木糖進行間歇發(fā)酵可獲得50g/L乙醇、0.35～0.44g/g的木糖和80％理論產量的發(fā)酵水解產物［21］。并且P.stipitis包含很多的編譯密碼，有內切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、幾丁質酶等。

3.2 革蘭氏陰性菌

研究對E.coli和Klebsiella oxytoca進行重組DNA，將混合酸的生產轉化成了乙醇的生產。通過克隆和表達K.oxytoca的乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶基因，重組菌株能夠在真菌纖維素增加時高效率轉化結晶纖維素成為乙醇［22］。其中100g/L的纖維素可得到乙醇的最大理論產量是81％～89％，乙醇滴定度高達47g/L。其它大腸桿菌的基因工程菌以60g/L生產乙醇［23］。并且通過代謝工程技術，乙醇的產量可以進一步增加。重組大腸桿菌可發(fā)酵玉米纖維水解產物得到35g/L乙醇［24］，所用時間為55h，每克有效糖產0.46g乙醇（以最高產率90％）。玉米纖維中70％是碳水化合物，由纖維素和半纖維素組成，對玉米纖維最好用烯酸進行預處理，這樣就可避免抑制產物（如糠醛、來自木質素的5-羥甲基糠醛酸等）的生成，在發(fā)酵過程中加入纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，可使單糖產乙醇量的理論值高達85％～100％［25］。用氨水對玉米纖維進行前處理，再通過重組大腸桿菌進行發(fā)酵，可得乙醇產率為27g/L［26］。

3.3 對真菌纖維素酶的需求

以上討論的酵母菌和革蘭氏陰性菌發(fā)酵過程都需要添加真菌纖維素酶（纖維素二糖水解酶Ⅰ），此酶可由Trichoderma reesei制得，由此得到了同步糖化發(fā)酵（SSF）過程［27］。纖維素酶通常由發(fā)酵菌產得，而只有革蘭氏陽性的厭氧過程（革蘭氏陽性厭氧菌）不需要此酶。

T.reesei可以誘導纖維素生成纖維素酶，纖維素酶低構成水平是通過水解某些纖維素成為小的可溶性引誘物，然后再誘發(fā)形成高濃度的纖維素酶［28］。以往得到此酶的成本很高，但在過去幾年中，由于杰能科國際公司和諾維信公司與能源部的撥款（共計3000萬美元），研究者通過酶工程和發(fā)酵工程使T.reesei纖維素酶的成本降低超過10倍［29］。然而，酶的價格仍需進一步降低。

3.4 革蘭氏陽性厭氧菌

目前，研究者正在研究用細菌（如梭狀芽孢桿菌用）生產乙醇，它們之所以具有利益價值，是因為它們可以利用纖維素廢物并生成乙醇，這是生物間罕見的效果。細菌的纖維素酶體系能調解含有木質素材料（如硬木樹）的水解產物，人們可以先通過烯酸以及不包含木質素的培養(yǎng)基進行前處理。原則上，厭氧乙醇發(fā)酵的概念是非常簡單的，即乙醇生產過程中一個單一發(fā)酵與五個生物學中間體反應：（1）纖維素酶和半纖維素酶的形成；（2）纖維素和半纖維素的水解；（3）糖和低聚糖的攝??；（4）己糖發(fā)酵；（5）戊糖發(fā)酵，所有反應均在一個單一的過程中發(fā)生。此厭氧工藝的優(yōu)點是可以減少在生物降解酶反應容器中攪拌/通氣的能量消耗。厭氧菌一般具有較低的細胞生長產量，因此，更多的培養(yǎng)基可被轉化成乙醇，并且在原纖維素酶上生產比添加纖維素酶更加經濟。除了嗜溫性厭氧菌，嗜熱性厭氧菌也被廣泛用于乙醇的生產，原因如下：（1）酶生產、糖化和乙醇生產的單步性，從而消除了需要真菌酶的成本；（2）嗜熱細菌有健全和穩(wěn)定的酶控制；（3）在60℃高溫下發(fā)酵可以產生較少有害污染影響；（4）在高溫下生長有便于移走并重得揮發(fā)性產物（如乙醇）；（5）生長率高，對纖維素和半纖維素的代謝速度快；（6）低細胞生產量可以使更多的基質轉化成乙醇；（7）在氧轉化、發(fā)酵罐的攪拌和冷卻上能量的消耗減少。嗜熱厭氧菌（如Clostridium thermocellum）可使纖維素酶生產、糖化和發(fā)酵一體化，C.thermocellum可以直接將廢物纖維素和結晶纖維素轉化成乙醇［30］，其纖維素酶體系由許多酶復合物構成。C.thermocellum將纖維素分解成纖維素糊精和纖維二糖，這些產物可被細胞攝取并進一步利用，最終的產物是乙醇、乙酸、乳酸、氫和二氧化碳。這種微生物能最高效率的利用纖維素，并對結晶纖維素有著最高的生長速率。

由于梭狀芽胞桿菌（如C.thermocellum）沒有使戊糖（來自半纖維素）轉化成乙醇的能力，混合培養(yǎng)的概念就誕生了。對嗜熱厭氧菌進行混合培養(yǎng)，可使纖維素生物質轉化乙醇的成本降低兩倍。人們利用資源研究細菌組合，將農業(yè)、林業(yè)和城市資源轉化為乙醇，成為石油資源的替代品，從而可以提高經濟效益，這種現(xiàn)代技術稱為"綜合生物處理過程（CBP）"［15］，它可成為產乙醇商業(yè)化的重要手段。厭氧培養(yǎng)體系的優(yōu)點有：消除了酶生產的資本和運營成本、大大降低了產酶培養(yǎng)基的轉移、酶和發(fā)酵體系的兼容。共培養(yǎng)過程是先經過酸的溫和前處理，再最大限度地水解和發(fā)酵木質纖維素/半纖維素生物質［30］。CBP過程包括：（1）采用C.thermocellum發(fā)酵生產纖維素酶和半纖維素酶；（2）水解纖維素為纖維低聚物和纖維二糖；（3）將半纖維素轉化為阿拉伯木聚糖、木二糖、低聚木糖和戊糖；（4）低聚糖和葡萄糖的攝?。唬?）C.thermocellum發(fā)酵己糖生成乙醇；（6）T.saccharolyticum.發(fā)酵戊糖生成乙醇。

在進行共培養(yǎng)時，采用纖維糊精磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶進行磷酸化切割，可從纖維素中攝取低聚糖和葡萄糖。相對于通過外因使纖維素水解為纖維二糖，用很多蜂窩狀磷酸化酶的磷酸化切割更有效用，因為后者具有較低的Km值，因此纖維糊精比纖維二糖更容易被利用［31］。細胞新陳代謝的另一個關鍵點是在磷酸化過程中產生了正ATP平衡。

雖然共培養(yǎng)體系非常有前途，但還是存在一些不足：一是發(fā)酵產乙醇過程中的終產物抑制［32］，此弊端可通過將稀培養(yǎng)液中的乙醇蒸餾掉來抵消；另一點是由于副產物乳酸和醋酸的生成造成乙醇產量低。針對低乙醇產量有兩種解決方法：一是消除新陳代謝的分支，此法需調查研究可能影響兩個共培養(yǎng)生物體間基因轉化的因素，但由于缺乏這些共培養(yǎng)物分子基因的信息，研究受到了阻礙；另一種是淘汰醋酸激酶和乳酸脫氫酶基因，它們負責分支代謝途徑，進行此操作的一個先決條件是外源DNA插入細菌的能力，目前研究已取得了一些進展，可通過電轉化和外源紅霉素耐藥特點的表達，使C.thermosaccharolyticum成功的轉化［33］。

4 結論與展望

自20世紀70年代，人們一直處于一個動蕩的能源時代。美國是由玉米生產乙醇，巴西由蔗糖生產乙醇。然而至少是在美國，人們先基本用完玉米再研究尋求新原料。首先人們利用農場和森林中的木質纖維素生物質來研究制備生物燃料，隨后城市垃圾也作為制備生物燃料的原料。在未來，生物制品（生物乙醇、丁醇、生物柴油、其他的短鏈醇和生物碳氫化合物）的研究將越來越多，并且一本有關生物能源的新書提到，生物可利用物還包含沼氣、生物甲醇、生物氫和微生物燃料電池等［2］。這些潛在的能源會增加我國的能源獨立和國土安全，并減少溫室氣體排放以及避免一系列的環(huán)境問題，同時也會推動這動蕩的經濟達到平和。在微生物和遺傳方面，對大部分微生物已做了很多基礎工作，但在建立生產生物燃料的新工廠方面，仍需人們進一步努力，新反應過程需在兼顧效率與成本的情況下進行擴大化生產。很明顯，生物燃料的未來非常光明。

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