孔俊豪，孫慶磊，涂云飛，陳小強，高玉萍，楊秀芳

(中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016)

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，以下簡述為PPO)是核基因編碼的銅金屬酶，廣泛存在于植物體的各類器官或組織中，如花器官、分生組織、葉片、塊莖、根中，在傘菌目子實體內含量也較豐富。在正常狀態(tài)下，細胞內多酚氧化酶與細胞器內膜結合，活性很低，但遭遇外界逆境時，PPO可以增加植物體對病原體的抗性［1］。然而當組織完整性破壞或膜受到傷害后，潛在的PPO大量被激活，質體內的多酚類物質在PPO作用下氧化成醌，植物組織的褐變隨之發(fā)生。此外，在茶葉加工中，可依據不同的加工工序來協(xié)同調控PPO活性從而制成品質與滋味迥異的不同茶類［2］。

1 影響酶活的主導因素

1.1 來源

不同來源的PPO對于專一性底物的親和力存在很大差別，部分原因在于同空間因子相關的酶蛋白質結構上的差異。吳進菊等［3］對多種植物和真菌中PPO的催化活性進行了比較，結果表明，茄子＞雙孢蘑菇＞蘋果＞梨＞山藥＞馬鈴薯＞芋艿＞香蕉＞萵苣(比酶活)。同一植株內，不同成熟度、不同部位的PPO酶活性也有差異，一般在幼嫩部分酶活總量高于成熟部分。周春梅等的研究表明，白玉菇下柄的PPO酶活性最高，菌柄的PPO酶活性高于菌蓋的PPO酶活性。姜紅波等［4］對茶樹菇不同部位的粗酶液活性測定表明，菌柄下酶活性最小;菌蓋與菌褶處酶活性較大。與同類研究［5］得出的結論相似。

1.2 底物

PPO在不同的底物體系(一元酚和鄰二酚)中，可以催化完全不同的氧化反應。底物不僅取決于植物組織、真菌子實體的種類，而且從同一種果蔬的不同品種分離得到的PPO也具有底物特異性。劉雅嘉等［6］研究了香菇PPO基于不同底物的Km值，其與三種底物間的親和力強弱依次為L－多巴＞一水沒食子酸＞鄰苯二酚。

王麗霞等［7］以福云六號茶鮮葉為原料，以鄰苯二酚為反應的底物，探討了其中多酚氧化酶的特性，結果表明，在供試反應體系中，酶活性隨底物量逐漸增長，但底物含量過高也會產生抑制作用。

1.3 作用溫度

溫度對于酶的催化活力具有重要的影響。PPO溫敏性較強，多數(shù)情況下，在70～90℃下短時熱處理已足以使它部分或全部地不可逆失活。

而PPO酶的熱穩(wěn)定性在一定程度上亦決定于其來源，存在于不同的質體、組織或同一的質體不同部位的PPO，其對熱處理的耐受度有差異，宋金隆等［8］比較了茶樹鮮葉、馬鈴薯、蘋果中的PPO酶活性，表明不同來源，最適催化溫度的不同，但溫度變化對酶活力的影響趨勢大體一致。經研究發(fā)現(xiàn)，茶葉PPO活性隨著溫度的變化呈現(xiàn)出先強后弱的趨勢，高溫對酶活的抑制作用更為明顯［9］。低溫效應度對酶活力的影響主要是降低PPO催化活力或使之處于可逆失活狀態(tài)。夏濤等［10］研究了冷凍萎凋對茶葉PPO的影響，低溫凍結狀態(tài)下酶活變化不顯著，但復溫萎凋后活性下降達一半以上，溫差造成細胞破裂致酶活損失。因此調節(jié)反應溫度可以有效調控、提高PPO的催化活性。

1.4 pH 值

PPO作用的最適pH隨酶的來源和選用的底物而變。多數(shù)情況下，果蔬中的 PPO最適 pH在4.2～7.0之間，不同的作用底物、提取緩沖液、分離方法對酶的最適pH也有影響，因此PPO的最適pH只在一定條件下才有意義［11］。在一些情況下，PPO具有兩個最適pH，同工酶或多種分子形式是其可能原因之一。

李敏等［12］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯PPO粗酶液活性隨體系pH增加而增強，最適pH約在5.5處，同類研究［13］證實，楊梅果實中PPO活性隨pH變化趨勢與上述一致，受試范圍體系pH接近中性時，PPO催化活性最強。不同真菌果實中PPO的活性變化均與pH之間存在一定相關性［14］。

1.5 儲放條件

果蔬采后其PPO在相當長的時間內仍處于生理活性狀態(tài)，對于植物質體的調節(jié)水平隨儲藏條件而變。朱鳳妹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，與新采馬鈴薯相比，貯藏一定時間后的馬鈴薯中總體PPO活性趨于下降。程建軍等［16］對蘋果梨中PPO活性在室溫儲藏過程中變化規(guī)律，蘋果梨PPO活性先呈降低趨勢，而后緩慢恢復，但活性變動幅度無統(tǒng)計顯著性，室溫保藏期間PPO活性高于低溫保藏，呼吸強度大，刺激多酚類物質氧化聚合，破壞了PPO－多酚類物質之間的動態(tài)平衡，加速了果肉褐變。

2 酶活的輔調因素

2.1 激活劑和抑制劑

為防止酶促褐變，食品界在PPO的抑制劑方面開展了很多研究工作，而對于其激活劑相對了解較少。

陰離子洗滌劑如SDS(十二烷基硫酸銨)能激活PPO。SDS不僅可激活經PVP處理而失活的酶，而且也能夠激活以潛在形式存在于粗提液中的PPO。適宜的添加濃度范圍內，SDS對煙草PPO及嫩刺芽PPO均有一定的激活作用［17－18］。PPO的活性形式是含銅的酶單體的寡聚體，因此含Cu2+的化合物對源于小麥等的PPO也有激活效應［19］。

此外，金屬離子能以不同的方式與底物、酶的活性產物和酶本身產生極強的親和力，從而導致酶活性的改變。Ca2+和Na+能對酶活性產生抑制作用，Al3+、Fe3+、Cd2+、Co2+、Mn2+和 Zn2+則激發(fā)酶的催化功能［20］。

PPO的抑制劑依據其作用機制不同可分為酶基抑制劑和產物(或底物)抑制劑兩類，第一類中具有產業(yè)應用價值的是抗壞血酸和檸檬酸，第二類中較有代表性的有二氧化硫、半胱氨酸、亞硫酸鹽等。就茶葉PPO而言，NaHSO3對其抑制作用最顯著，其次為L－半胱氨酸、抗壞血酸和EDTA，效果最差的為NaCl［7］，半胱氨酸對多種植物，如蘋果、馬鈴薯、香蕉等體內的PPO都有抑制作用［21－23］。也有學者通過抑制劑復合協(xié)同進行抑褐保鮮，篩選得到了山藥最佳感官風味的PPO抑制劑配方:0.05%檸檬酸+0.4%抗壞血酸 +0.02%EDTA［24］。

2.2超高壓

超高壓，又稱液態(tài)高靜壓，以水和礦物油作為傳遞壓力的介質，施加高靜壓(100～1 000 MPa)，并維持一定時間后可以改變食品的物化特性和化學反應速度，達到殺菌和改變酶活性的一種加工方法。和熱協(xié)同處理可以減少果蔬中熱敏物質的流失，低溫熱處理即可達到顯著性鈍化PPO的效果，但不同的壓力可對PPO的活性產生抑制或激活作用［25－26］。

2.3 微波輻照

微波滅酶處理具有熱特性和非熱特性。輻照對茶葉中PPO活性的抑制程度受劑量影響，低于或高于最佳劑量均不能達到理想的效果［27］，輻照處理協(xié)同理化因子調控可提高對酶活力的抑制程度，研究表明3kGy輻照劑量與適宜pH復合處理能夠抑制梨汁中92%的PPO活性［28］。微波作用改變酶液中的鍵合作用，從而改變蛋白質的構象［29］，體系在生物效應和熱效應的雙重作用下，PPO活性被迅速鈍化。

2.4 脈沖電場

脈沖場通過電場強度的變化改變PPO的二級結構，影響其構象從而使酶滅活［30］，而且酶的殘余活性隨著磁場強度和脈沖數(shù)的增加而逐漸降低，最高滅活率可達90%以上［31］。

2.5 振動

振動脅迫在一定程度上也對PPO有抑制作用。肖麗娟等［32］研究發(fā)現(xiàn)水蜜桃果實在貯藏過程中，振動處理組PPO活性始終高于對照組，并且振動時間越長PPO活性越高。茶葉初制加工過程中，經振動處理的茶鮮葉PPO活性會迅速降低，振動強度越大，下降越快［33］。

3 應用研究進展

PPO對于果蔬保鮮和采后加工具有重要意義，為避免褐變造成的食品品質下降，加工過程中PPO酶的鈍化處理一直是研究的熱點，而在不同茶類加工過程中合理調控茶葉PPO活性對于茶葉品質的提升。

3.1 果蔬保鮮褐變控制中的應用

PPO抑制在防止水果和蔬菜褐變方面起著重要的作用。抑制PPO活性或消除酶促反應的發(fā)生條件能較好地保持鮮果的色澤、風味及營養(yǎng)。酶促褐變的發(fā)生需要三個條件:底物(多酚類物質)、氧介質、PPO［34］。實際操作中從食品中除去PPO的底物(多酚類物質)不僅困難，而且不現(xiàn)實。因此比較有效的是抑制PPO活性，其次是防止與氧接觸。

3.1.1 溫度調控

冰溫保藏，是將食品貯藏在0℃以下至各自的凍結點的范圍內的保鮮方式，繼冷藏和氣調之后，成為第三代保鮮技術。冰溫可以抑制PPO酶活，減少總酚含量的下降趨勢，對果蔬的保鮮有著明顯的作用。冰溫貯藏作為一種新型的物理保鮮方法，研究表明［35］其對蓮藕保質期比冷藏要長，并且冰溫貯藏后的果實以低溫冷鏈方式出庫后其PPO在貨架期內始終處于較低水平［36］，對于延長鮮食果蔬的貨架壽命收效顯著。

瞬時高溫可使包括PPO在內的酶鈍化，熱處理是生產中常用鈍酶方法之一，通常以PPO作為熱燙指示劑，常以蒸汽或熱水為濕媒介，通過熱燙或漂燙工藝用于壓榨果汁的預處理［37］，提高產品中功能成分含量，改善速凍食品的感官品質和風味，不過在工業(yè)中漂燙的最佳終點判斷至關重要。不同的果蔬品種，具體處理參數(shù)不同，適度的處理時間內亦可提高出汁率，時間過長則會導致營養(yǎng)成分流失［38］。

3.1.2 酸度調控

大多PPO最適pH值在6.0～7.4范圍，在pH值降至4.0以下，PPO幾乎完全失去活性。因此利用調酸降低pH值的方法抑制果蔬褐變，是果蔬加工中常用的方法?？刹捎眉尤脒m量的pH調節(jié)劑如檸檬酸、蘋果酸、醋酸等降低pH值，抑制褐變發(fā)生率，多為兩種或兩種以上復合使用，且符合食用級標準。喬勇進等［39］研究表明pH對貯藏梨汁褐變影響較大，隨著pH降低，梨汁褐變度越大。

3.1.3 抑制劑調控

Vc、NaHSO3、L－Cys、EDTA 對各種來源的 PPO的活性都有抑制作用。Vc不僅可降低環(huán)境pH值，它與異Vc鈉既能抑制PPO本身的催化作用，同時又能還PPO形成的產物醌為酚，并且還能消耗反應體系中的氧而L－Cys既能與醌形成無色的聚合物，又是醌的還原劑，還原醌為酚［40］。另外EDTA可與酶分子中Cu2+絡合抑制酶活性，甚至飽和NaCl也能顯著抑制酶活性［1，7］。因此適量加入這些抑制劑來抑制PPO活性是控制酶促褐變的有效途徑之一。在實際生產中較為理想的抑制劑是Vc，這是由于Vc是水果中的成分，安全性高，因此在工業(yè)生產中可以廣泛地應用。

3.2 茶葉加工中的應用

3.2.1 綠茶殺青

綠茶加工過程中，關鍵工序是殺青，通過高溫(100～300℃)使鮮葉中的酶迅速變性失活，及時終止鮮葉中包括PPO在內的各類酶促反應，使成品茶保留較多的葉綠素、多酚類、維生素C等熱敏性品質成分，從而形成綠茶“清湯綠葉”的品質。傳統(tǒng)的殺青方法包括蒸氣殺青、鍋炒殺青，近年來有微波殺青、遠紅外輔助殺青、超高壓等新技術用于綠茶殺青處理過程［41－43］，對于酶質的活性進行柔性鈍化，更有利于茶葉理化成分的保留和優(yōu)良品質的形成。

3.2.2 紅茶發(fā)酵

紅茶屬酶性氧化茶類，須滿足多酚類酶性氧化聚合反應所需要的最適溫度、濕度和氧氣條件。經萎凋、揉切后，茶葉中PPO酶類活性得到激活，PPO與多酚類及空氣充分接觸，使多酚類中的沒食子兒茶素及其沒食子酸酯先行氧化為鄰醌，再逐步氧化縮合，成為茶黃素和茶紅素，使紅茶具有湯色葉底紅亮、香味濃郁等獨特品質。

日本靜岡茶試站早在20世紀90年代即通過在紅茶發(fā)酵過程中添加外源微生物PPO以提高茶黃素的合成量，以此改善紅茶品質［44］。近年來國內也有將外源引入液態(tài)發(fā)酵協(xié)同茶葉自源PPO進行茶制品生產，實現(xiàn)過程的動態(tài)調控，以提高產品品質和制率［45］。

此外半發(fā)酵茶如烏龍茶的萎凋、搖青工序及白茶的萎凋等均屬利用茶青中PPO酶的活性進行初制加工形成特征各異的茶類成品。采用差異化工藝條件的控制，利用或抑制茶葉PPO的活性從而借助不同的氧化伴生反應形成品質獨特的茶類產品開發(fā)已成為當前茶葉加工的一大研究熱點。

4 應用研究展望

多酚氧化酶是生物質體的自源代謝酶類，不僅在生物體的生長期維持自體次生代謝的平衡，也與果蔬采后生理和再加工產品品質有著緊密的聯(lián)系?？刂乒咧诩庸?、儲藏過程中的酶促褐變，保留、改善農副產品的營養(yǎng)成分和感官品質符合消費者對健康產品的食用價值需求。

當前，人們已經從物料自身酶的活性和酶促反應的輔助因子、外界環(huán)境等的控制等多方面入手，找到了多種控制果蔬汁中酶促褐變的有效方法。但是因為不同果蔬物料中的PPO具有特異性，根據果蔬品種的不同，單一的方法存在一定的局限性。隨著非熱加工技術的發(fā)展，超高壓、輻照、脈沖場、冰溫貯藏等在酶作用機制方面的廣泛研究和協(xié)同化應用，為果蔬加工過程控制褐變提供了相對廣闊的工業(yè)化技術和理想方法。

同樣，PPO作為茶葉產品加工過程中的重要品質決定因素，隨著市場差異化產品的需求，應用新型加工技術及酶工程技術，針對性地創(chuàng)設PPO活性調控的理化條件，充分發(fā)揮PPO的生理催化優(yōu)點，進而專一性改善茶葉產品中某一類成分的含量，提高茶制品的風味和質量，將會是未來新型茶制品開發(fā)的一大研究亮點，有著廣闊的應用前景。

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