梁小鋒(綜述),周龍虎,雷續(xù)虎(審校)

(1.西北政法大學(xué)公安學(xué)院,西安 710063;2.常熟市公安局,江蘇常熟 215500;3.解放軍第 323醫(yī)院,西安 710068)中圖分類(lèi)號(hào):Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-2084(2011)02-0167-03

基于聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR)的熒光標(biāo)記短串聯(lián)重復(fù)序列 (short tandem repeat,STR)復(fù)合擴(kuò)增分型是目前法庭科學(xué)生物物證DNA分析的常規(guī)主流技術(shù)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的可比性等 DNA證據(jù)的要求,一般都使用商品化的試劑盒進(jìn)行 PCRSTR分型。目前,根據(jù)試劑盒生產(chǎn)廠家的推薦,進(jìn)行STR分型時(shí)理想的模板DNA量要求在 0.2～3 ng(簡(jiǎn)稱(chēng)常量模板 DNA),通常獲得最佳分型效果的模板DNA量為 1 ng左右[1]。模板DNA量過(guò)高與過(guò)低都會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題,如位點(diǎn)間的不平衡擴(kuò)增、+/-A等位基因丟失或插入等[2]。然而,法醫(yī) DNA分析技術(shù)在相關(guān)案件中的重要作用又使得越來(lái)越多微量、超微量、腐敗降解的生物物證檢材,即低模板量DNA(low template DNA,LT-DNA),被提取并要求進(jìn)行DNA的 STR分型?，F(xiàn)對(duì) LT-DNA STR分型方法予以綜述,并就存在的相關(guān)問(wèn)題加以討論。

1 LT-DNA

法庭科學(xué)界目前關(guān)于LT-DNA并無(wú)明確界定,也有稱(chēng)之為低拷貝模板 (low copy template,LCN)。實(shí)際上,稱(chēng)之為L(zhǎng)T-DNA更為合適。因?yàn)長(zhǎng)T-DNA STR分型不是基于 PCR擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)數(shù) (LT-DNA可通過(guò)但不限于增加 PCR循環(huán)數(shù)來(lái)提高 DNA量)。Gill等[3,4]將 DNA模板量 <100 pg的定義為 LT-DNA, Caddy等[5,6]認(rèn)為 <200 pg的就可以稱(chēng)為 LT-DNA。由于 DNA定量方法之間會(huì)存在差異,Budowle等[7]則認(rèn)為:常規(guī) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 STR分型時(shí)無(wú)法獲得結(jié)果或 RFUs(相對(duì)熒光素單位)低于正常分析隨機(jī)閾值的模板DNA稱(chēng)為L(zhǎng)T-DNA更為科學(xué)。通常,隨機(jī)閾值設(shè)定為 150～250 RFUs。實(shí)際上,隨機(jī)閾值的設(shè)定值在實(shí)驗(yàn)室間是存在差異的。另外,混合檢材中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)某種低混合比例的成分為L(zhǎng)T-DNA(DNA總量可能為常量)?？梢?jiàn),LT-DNA也存在于常規(guī)循環(huán)數(shù)(28個(gè)循環(huán))的 PCR產(chǎn)物中。因此,將LT-DNA定義為“常規(guī)標(biāo)準(zhǔn) STR分型檢驗(yàn)時(shí),對(duì)檢測(cè)信號(hào)低于正常分析隨機(jī)閾值的任何檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析及解釋時(shí)所對(duì)應(yīng)的模板DNA”更為合適。

2 LT-DNA STR分型方法

LT-DNA STR分型早在 1996年 Taberlet等[8]就有報(bào)道,隨后相繼有更多學(xué)者研究報(bào)道,1999年英國(guó)法庭科學(xué)服務(wù)部將LT-DNA STR分型結(jié)果應(yīng)用于案件中。目前,LT-DNA STR分型方法幾乎都是基于常規(guī)商品化試劑盒進(jìn)行分析的。

2.1 由 LT-DNA STR分型轉(zhuǎn)化為常量 DNA STR分型

2.1.1 改進(jìn)DNA提取方法 法醫(yī)常規(guī)生物檢材通過(guò) Chelex-100法就可獲得常量模板 DNA進(jìn)行 STR分型,對(duì)于 LT-DNA生物檢材,可以采用 Microcon100、Clean up、Q IA-micro、Q IA-EZA、硅珠法等多種純化與濃縮方法改進(jìn)DNA提取,獲得盡可能多及盡可能純的模板DNA。

2.1.2 增加 PCR循環(huán)數(shù),提高 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)增加 PCR循環(huán)數(shù)來(lái)提高擴(kuò)增敏感度,并被證明 100%有效。研究結(jié)果[3]表明,使用 34個(gè)循環(huán)數(shù)分型效果最佳。大于 34個(gè)循環(huán)并未顯示出優(yōu)勢(shì)。而且隨著循環(huán)數(shù)增加,Taq酶的效率會(huì)逐漸降低,同時(shí)基于實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作的污染不可避免地也增加。目前這個(gè)方法已成為英國(guó)、澳大利亞等許多國(guó)家分析LT-DNA樣本最主要的手段。也有學(xué)者提出34個(gè)循環(huán)對(duì)LT-DNA并非最佳,因?yàn)樵黾拥碾S機(jī)效應(yīng)明顯提高了偽等位基因的發(fā)生率。Anjos等[9]提出在 32或 28個(gè)循環(huán)后加入 Taq酶,之后再進(jìn)行 4次或 6次擴(kuò)增效果會(huì)更好,可明顯減少各種隨機(jī)效應(yīng)。陳連康等[10]也認(rèn)為,在 28次后加入 Taq酶再循環(huán) 6次比單一 34次循環(huán)的結(jié)果更好。Balogh等[11]應(yīng)用增加循環(huán)次數(shù)的方法從紙上潛在指紋中獲得了供者的 STR圖譜,同時(shí)也指出 38個(gè)循環(huán)最有效。

2.1.3 提高毛細(xì)管電泳檢測(cè)敏感度 許多學(xué)者還提出減小 PCR反應(yīng)體積、過(guò)濾 PCR產(chǎn)物以得到更加濃縮的擴(kuò)增產(chǎn)物[12,13],同時(shí),使用傳導(dǎo)率低的高純甲酰胺、延長(zhǎng)進(jìn)樣時(shí)間、增加電壓等方法[14,15]在電泳分離時(shí)加入更多的擴(kuò)增產(chǎn)物,提高檢測(cè)敏感度。

2.2 激光捕獲顯微切割和 PCR前的全基因組擴(kuò)增

對(duì)含有LT-DNA的混合檢材通過(guò)上述辦法無(wú)法進(jìn)行 STR分型檢測(cè)。如果能把LT-DNA從混合檢材中分離出來(lái),然后應(yīng)用上述辦法或全基因組擴(kuò)增就可以完成復(fù)合 STR分型檢測(cè)。近年發(fā)展起來(lái)的激光捕獲顯微切割 (laser capture microdissection,LCM)技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、準(zhǔn)確地獲取所需單個(gè)細(xì)胞或單一細(xì)胞群。LCM技術(shù)是 1996年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(N IH)國(guó)家腫瘤研究所的 Emmert-Buck等所開(kāi)發(fā),次年,美國(guó) Arcturus Engineering公司成功實(shí)現(xiàn)激光捕獲顯微切割系統(tǒng)商品化銷(xiāo)售。利用LCM可以實(shí)現(xiàn)混合斑的有效分離,獲得高純度的LT-DNA,同時(shí)避免了干擾物質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。同時(shí)利用LCM也可以捕獲富集一般檢材中的 LT-DNA,保證后續(xù)STR分型的質(zhì)量。Martino等[16]應(yīng)用該技術(shù)方法從單根頭發(fā)毛囊細(xì)胞中提取到DNA并成功獲得了 STR圖譜,從 30個(gè)單倍體精子細(xì)胞中獲得了完整的 STR圖譜,從 5～10個(gè)精子細(xì)胞中獲得了絕大部分圖譜。該方法隨后被成功用于西西里一起少女遭受性攻擊的案件調(diào)查。國(guó)內(nèi)周懷谷等[17]通過(guò) LCM捕獲了 25個(gè)陰道上皮細(xì)胞和 100個(gè)精子細(xì)胞,并成功進(jìn)行 STR分型。顧麗華等[18]從分離出的 7～8個(gè)口腔上皮細(xì)胞中獲得了 STR分型。

當(dāng)模板DNA量極少時(shí),PCR擴(kuò)增就會(huì)發(fā)生隨機(jī)效應(yīng),導(dǎo)致雜合子樣品會(huì)造成明顯不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增,甚至造成等位基因丟失,從而使 STR分型錯(cuò)誤[13]。因此,利用LCM獲得的單個(gè)細(xì)胞用常規(guī)試劑盒無(wú)法分型成功。所以有學(xué)者提出利用全基因組擴(kuò)增 (whole genome amplification,WGA)技術(shù)先對(duì) LT-DNA進(jìn)行復(fù)制,產(chǎn)生大量高品質(zhì)DNA,然后對(duì)這些全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行 STR位點(diǎn)的 PCR復(fù)合擴(kuò)增、熒光檢測(cè),就可以得到了明確的DNA分型結(jié)果。WGA是一系列針對(duì)樣本DNA全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù),目的是在無(wú)序列傾向性的前提下大幅增加DNA總量,以利于隨后的擴(kuò)增。常用的WGA方法包括擴(kuò)增前引物延伸法、簡(jiǎn)并寡核苷酸引物法及多重置換擴(kuò)增等[19]?；诙嘀刂脫Q擴(kuò)增技術(shù)的全基因組擴(kuò)增方法在DNA復(fù)制時(shí)具有高度的保真性和準(zhǔn)確性,能夠精確地?cái)U(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的基因組DNA。周懷谷等[20]應(yīng)用多重置換擴(kuò)增技術(shù)從 10 pg的 DNA模板中得到了 STR圖譜。

理論上講,WGA由于首先對(duì)初始模板DNA進(jìn)行了全面均勻的放大,可以很好地解決 PCR反應(yīng)時(shí)LT-DNA隨機(jī)效應(yīng)的難題。但有學(xué)者[21]研究發(fā)現(xiàn), LT-DNA的隨機(jī)擴(kuò)增現(xiàn)象的確阻礙WGA的可靠性。因此,WGA不是解決LT-DNA STR分型的最終方法。

2.3 單分子 PCR擴(kuò)增分型 從上述研究方法來(lái)看, LT-DNA STR分型方法幾乎均采用常規(guī) PCR進(jìn)行擴(kuò)增,常規(guī) PCR對(duì)模板 DNA量有最低要求。然而, PCR理論指出,模板量最少可以到一個(gè) DNA分子,循環(huán)數(shù)可以是無(wú)限的。從這一理論出發(fā),發(fā)展了一項(xiàng)新的 PCR技術(shù)-單分子 PCR技術(shù)。單分子-PCR指的是以少量或單個(gè) DNA分子為模板進(jìn)行的 PCR,與常規(guī) PCR相比,具有以下優(yōu)點(diǎn):極少的模板數(shù),通常為 1、5或 10個(gè) DNA分子;更微型化的體系,大多在5～10μL。作為一項(xiàng)正在發(fā)展的新技術(shù),單分子-PCR也存在一些不足。由于體系使用極少的模板數(shù),引物間極易形成二聚體等副產(chǎn)物,這些副產(chǎn)物的大量堆積將嚴(yán)重阻礙正常的擴(kuò)增反應(yīng),因此技術(shù)上仍需要進(jìn)一步完善[22]。如能將單細(xì)胞 LCM與單分子-PCR相結(jié)合,無(wú)疑是解決LT-DNA STR分型的理想手段。

3 LT-DNA STR分型存在的相關(guān)問(wèn)題

3.1 污染的機(jī)會(huì)增加 PCR-STR分型的高敏感性導(dǎo)致污染是時(shí)刻存在的,LT-DNA的污染更是如此,極易受外源 DNA的污染,如談話(huà)、打噴嚏等都可以污染,污染機(jī)會(huì)大大增加。因此,在檢驗(yàn)過(guò)程中必須在無(wú)菌的環(huán)境中進(jìn)行,操作人員必須穿戴一次性手套、衣服及面罩,操作臺(tái)及設(shè)備必須經(jīng)常清洗和用紫外燈照射,實(shí)驗(yàn)的每一步均要使用陰性對(duì)照,以確定是否存在外源 DNA污染,這一點(diǎn)非常重要。同時(shí),盡可能地重復(fù)進(jìn)行 PCR檢驗(yàn),檢驗(yàn)結(jié)果必須與所有操作人員的 DNA分型進(jìn)行比較,必要時(shí),與現(xiàn)場(chǎng)生物檢材提取或案件調(diào)查人員的DNA分型進(jìn)行比較。

3.2 結(jié)果解釋的復(fù)雜性 在進(jìn)行LT-DNA STR分析時(shí),不容忽視的問(wèn)題是擴(kuò)增過(guò)程中的隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不均衡擴(kuò)增、等位基因丟失和插入及 Stutter產(chǎn)物顯著增加。而且,得到清晰分型圖譜的概率比較小,很多結(jié)果都是混合分型,所以目前很難給分型結(jié)果做出可靠的解釋。另外,檢材的數(shù)量極少,一次實(shí)驗(yàn)后就所剩無(wú)幾,不太可能按要求進(jìn)行第二次試驗(yàn)的重復(fù)性檢驗(yàn)?？墒请S機(jī)效應(yīng)的存在使得重復(fù)進(jìn)行PCR分析時(shí),所得到的 LT-DNA STR分型圖譜可能會(huì)有差異。這些都增加了結(jié)果解釋的復(fù)雜性?？梢哉f(shuō),LT-DNA STR分型的難點(diǎn)和最大的挑戰(zhàn)就是分型結(jié)果的正確解讀。

3.3 案件應(yīng)用的局限性 LT-DNA的研究結(jié)果使人們能夠從只遺留很少量嫌疑人細(xì)胞的各種案件現(xiàn)場(chǎng)得到 STR分型結(jié)果。由于分型的高敏感性,背景DNA或偶然接觸污染的DNA都有可能被檢測(cè)出來(lái),即使檢測(cè)到DNA分型,也可能無(wú)法解釋或本身就與案件無(wú)關(guān)。因此,LT-DNA STR分型一般不能用作排除的目的。另外,LT-DNA STR分型能為許多案件提供有用的調(diào)查線索,但不可能給每個(gè)案件提供可靠的科學(xué)證據(jù)。即使如此,LT-DNA STR分型也使法醫(yī)DNA分析得到了進(jìn)一步增強(qiáng)。

4 小 結(jié)

法庭科學(xué)工作者嘗試開(kāi)發(fā)更多的LT-DNA分型方法,上述分型策略部分可以聯(lián)合應(yīng)用以達(dá)到最優(yōu)化的分型結(jié)果。應(yīng)該通過(guò)更加嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制,排除一切外源DNA的污染,進(jìn)而保證分型結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。使用LT-DNA分型結(jié)果時(shí)應(yīng)持審慎態(tài)度?？梢灶A(yù)見(jiàn),隨著對(duì)LT-DNA的研究不斷深入,其在法庭科學(xué)中的作用會(huì)更大。

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