榮 健 葉 升 梁孟亞 劉 海 陳光獻(xiàn) 黃偉明 吳鐘凱*

1(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣州 510000)

2(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，廣州 510000)

3(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心外科，廣州 510000)

引言

肺缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)引起的肺功能障礙，是體外循環(huán)心臟手術(shù)后最常見的并發(fā)癥和導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1]。研究表明，控制性再灌注具有圍缺血期器官保護(hù)作用[2]。氧控制性再灌注可抑制心臟受損，提高再灌注后心臟功能[3]。但在肺缺血再灌注損傷方面，控制性再灌注研究多集中于離體肺或肺移植領(lǐng)域，在體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷領(lǐng)域未見研究。

體視學(xué)根據(jù)平面(二維)圖像數(shù)據(jù)，通過數(shù)理統(tǒng)計方法，推導(dǎo)出反映空間(三維)結(jié)構(gòu)參數(shù)，屬于定量分析方法。本研究根據(jù)體視學(xué)方法評估氧控制性再灌注對體外循環(huán)肺缺血再灌注早期損傷的作用，尋求體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的保護(hù)措施。相關(guān)研究國內(nèi)外未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康犬 14只，雌雄不限，體重(19.2±3.09)kg，廣州白云區(qū)穗北實驗動物養(yǎng)殖場提供。依據(jù)體外循環(huán)中吸入氧濃度方案的不同，隨機(jī)分為缺血再灌注組(IR組)和氧控制性再灌注組(OCR組)，每組7只。IR組全程FiO280%;OCR組在主動脈開放即刻調(diào)整 FiO2至40%，隨后每5 min依次上調(diào)10% ，最后達(dá)80% ，其余時段均維持FiO280% 。

1.2 麻醉方法及手術(shù)過程

肌肉注射氯胺酮40 mg/kg(福建古田藥業(yè)有限公司)和芬太尼 2 μg/kg(宜昌人福藥業(yè)有限公司)，靜脈注射維庫溴銨0.1 mg/kg(浙江仙琚制藥股份有限公司)行氣管插管，呼吸機(jī)(BIRD VELA，Model 606 A，USA)維持機(jī)械呼吸(潮氣量 13～15 mL/kg，呼吸頻率12～16次/min)，股動、靜脈分別插管測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)及中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)。胸骨正中劈開，切開心包，右心房內(nèi)注射肝素3 mg/kg，主動脈和上下腔靜脈分別插入16 F和18 F(Edwards Lifesciences LLC，Irvine，USA)插管，連接人工心肺機(jī)。升主動脈根部插入并固定16號針頭，連接灌注裝置。采用3 M人工心肺機(jī)，Medtronic膜肺(AFFINITY NT 541，Medtronic Inc.，USA)，Sarns變溫水箱(Sarns Heater/Cooler，Ann Arbor，MI)，以及東莞科威醫(yī)療儀器廠的塑料管道。兩組均以犬血部分預(yù)充。

1.3 CPB管理

兩組犬 CPB開始后，維持流量50～80 mL·min-1·kg-1，并體循環(huán) 10 min，阻斷升主動脈后，在主動脈根部灌注 4℃改良 ST.Tomas停跳液 15 mL/kg，阻斷升主動脈60 min后開放升主動脈，開放后輔助循環(huán)90 min。在開放主動脈后，如心臟出現(xiàn)室顫，則使用交流電除顫復(fù)跳。

1.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

在開胸后即刻(T1)、主動脈開放25 min(T2)、主動脈開放90 min(T3)留取肺標(biāo)本，部份以5%的福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片HE染色;部份進(jìn)行W/D測定。

1.5 分析方法和圖像分析軟件

病理標(biāo)本HE染色。每張切片在40倍物鏡下隨機(jī)選取10個視野，經(jīng)Leica顯微攝像系統(tǒng)輸入計算機(jī)，用 Image-Pro圖像分析軟件進(jìn)行測試。測試前，首先用物鏡測微尺對該軟件進(jìn)行標(biāo)定。

1.6 體視學(xué)參數(shù)的選擇和計算

選用的測量參數(shù)有：肺泡間隔中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)計數(shù)、肺泡間隔面積密度(area and density of pulmonary alveolar septum，PASAD)、肺泡腔體積密度和肺實質(zhì)紅細(xì)胞體積密度。根據(jù) Image-Pro圖像分析軟件的測試結(jié)果，按體視學(xué)公式計算出上述參數(shù)[4]。

1.7 肺組織濕重與干重比值

肺組織于4℃生理鹽水中漂洗，剔除結(jié)締組織，用濾紙吸干表面液體，稱濕重;然后置于80℃烘箱中48 h去除水分，再稱干重，計算濕干重比(W/D)。

1.8 統(tǒng)計分析

所有計量數(shù)據(jù)運用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計描述分析，計數(shù)數(shù)據(jù)運用百分位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計描述分析。為檢驗組間差異，對計數(shù)數(shù)據(jù)(discrete variable)進(jìn)行組間比較，采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗(K independent samples test);對計量數(shù)據(jù) (measurement data)，采用單因素方差分析(AVON)。對重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析(repeated measures analysis of variance)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡檢查

圖1為IR和OCR兩組的肺損傷比較，兩組犬肺組織在主動脈開放后均出現(xiàn)炎性細(xì)胞滲出、肺間質(zhì)水腫、肺間隔增厚等病理改變，但 OCR組組織病理學(xué)損傷程度相對較輕。按 Arold SP方法[5]對肺損傷進(jìn)行5級分類：0=最小損傷，1=輕度損傷，2=中度損傷，3=嚴(yán)重?fù)p傷，4=極度損傷。400倍光鏡下任取10個視野，計算平均每個視野所得分均值代表損傷程度。T2時點兩組肺損傷評分：(3.8±0.5)vs(2±0.7)，P ＜0.05;T3時點兩組肺損傷評分：(4.2 ±0.8)vs(2.6 ±0.6)，P ＜0.05。

圖1 兩組肺損傷比較(HE stain，40×)。(a)IR組 T1;(b)IR組 T2;(c)IR組 T3;(d)OCR組T1;(e)OCR組T2;(f)OCR組T3Fig.1 Lung injuries(HE staining of lung sections，40 × ).(a)IR group T1;(b)IR group T2;(c)IR group T3;(d)OCR group T1;(e)OCR group T2;(f)OCR group T3

2.2 肺泡間隔中性粒細(xì)胞(PMN)計數(shù)及肺泡間隔面積密度(PASAD)測定

表1為IR和OCR兩組肺泡間隔中性粒細(xì)胞計數(shù)和肺泡間隔面積密度的比較。兩組肺泡間隔中性粒細(xì)胞計數(shù)和肺泡間隔面積密度均逐漸上升，但在T2和T3時點，OCR組較IR組明顯降低，P＜0.05。

表1 肺泡間隔中性粒細(xì)胞計數(shù)和肺泡間隔面積密度Tab.1 PMN count，the area and density of pulmonary alveolar septum of two groups

2.3 各組肺泡腔的體積密度

表2為IR和OCR兩組肺泡腔體積密度的比較，可見兩組肺泡腔體積密度均逐漸下降，但在T2和T3時點，OCR組較IR組明顯增大，P＜0.05。

表2 兩組肺泡腔體積密度Tab.2 Volume density of alveolus of two groups

2.4 各組肺組織紅細(xì)胞的體積密度

表3為IR和OCR兩組肺組織紅細(xì)胞體積密度的比較，可見這兩組密度均逐漸上升，但在T2和T3時點，OCR組較IR組明顯降低，P＜0.05。

表3 兩組肺組織紅細(xì)胞體積密度Tab.3 Volume density of the erythrocyte in the lung of two groups

2.5 肺組織W/D比較

與T1相比，IR組和 OCR組 W/D在 T2、T3時點均明顯增高(P＜0.05);兩組相比，OCR組 W/D在T2、T3時點明顯低于IR組相應(yīng)時點(P＜0.05)。兩者比較見圖2。

圖2 兩組肺干濕重比較(*組間比較，P＜0.05;△與組內(nèi)T1比較，P＜0.05)Fig.2 W/D weight in the two groups(* compared between the two groups，P ＜0.05.△ compared with T1 in the group，P ＜0.05.)

3 討論

3.1 體視學(xué)方法評估體外循環(huán)肺缺血再灌注早期損傷

形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變是功能變化的基礎(chǔ)，而功能變化反過來又影響其形態(tài)結(jié)構(gòu)。體視學(xué)是“通過二維圖像的定量分析獲取數(shù)據(jù)以定量描述三維幾何，并在微觀組織分析中加以應(yīng)用的方法”[6]，應(yīng)用這種方法可以對肺實質(zhì)急性損傷進(jìn)行定量分析。

當(dāng)肺泡受損時，炎癥細(xì)胞(特別是中性粒細(xì)胞)聚集，肺泡間隔增厚并，有炎癥細(xì)胞浸潤。肺泡間隔中性粒細(xì)胞計數(shù)愈大，提示炎癥程度愈厲害。肺泡間隔面積密度，是指在單位面積肺實質(zhì)中，肺泡間隔所占的比例。肺泡腔的體積密度，是指單位體積的肺實質(zhì)中肺泡腔所占的體積。當(dāng)肺實質(zhì)由于炎癥、水腫、滲出、出血等原因?qū)е路闻萸惑w積減小時，肺泡腔體積密度會降低，其體積密度的變化隨著肺實質(zhì)炎性滲出的增多而減小。肺泡紅細(xì)胞的體積密度，是指單位體積的肺實質(zhì)中紅細(xì)胞所占的體積。當(dāng)肺組織因炎癥或其他因素導(dǎo)致肺組織出血、充血時，其體積密度會增加。肺組織的病變越重，出血、充血越明顯，其體積密度越大。本實驗檢測了體視學(xué)指標(biāo)及反映肺損傷的濕干重比，發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)肺缺血再灌注早期即有損傷出現(xiàn)，這與肺損傷五級評分結(jié)果相符。

3.2 體視學(xué)方法評估氧控制性再灌注的肺保護(hù)作用

肺損傷是臨床體外循環(huán)術(shù)后最主要的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高達(dá)15% ～30%[7]，肺缺血再灌注是其主要原因之一[1]。再灌注后氧供突然增加，在線粒體細(xì)胞色素P450系統(tǒng)作用下，產(chǎn)生大量毒性氧代謝產(chǎn)物;并且在再灌注大量氧供下，缺氧通過 p38 MAPK途徑激活的黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生大量ROS。這些活性氧代謝產(chǎn)物導(dǎo)致器官損傷。因此，再灌注期逐漸恢復(fù)氧供可減少ROS的產(chǎn)生，具有器官保護(hù)作用。有研究報道，氧控制性再灌注可保護(hù)肺血管內(nèi)皮功能，減輕全身缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷[2];減輕腦 、小腸缺血再灌注損傷，抑制炎性反應(yīng)[8-9];維持全身缺血再灌注時血流動力學(xué)的穩(wěn)定[10]。無資料提示體外循環(huán)期間控氧對肺缺血再灌注損傷的作用。本實驗將氧控制性再灌注應(yīng)用于犬體外循環(huán)肺缺血再灌注模型，通過體視學(xué)定量方法來評價肺組織炎性細(xì)胞浸潤、肺微血管通透性、肺組織充血出血，發(fā)現(xiàn)氧控制性再灌注可減輕體外循環(huán)肺缺血再灌注早期肺組織滲出，抑制中性粒細(xì)胞。結(jié)果表明，再灌注早期控制氧供可改善肺損傷的嚴(yán)重程度，但臨床實施方案及遠(yuǎn)期效果有待進(jìn)一步的研究。

3.3 體視學(xué)方法評估體外循環(huán)肺損傷的優(yōu)勢與精確性

二維定量研究是目前評價肺損傷的重要方法。但是，傳統(tǒng)定量方法是在所要研究區(qū)域內(nèi)任意選擇少量的“典型”部位，運用二維定量技術(shù)對所研究的參數(shù)進(jìn)行二維定量研究，但缺乏隨機(jī)抽樣。而體視學(xué)方法是基于二維切片的全面觀察而獲得顯微結(jié)構(gòu)的三維定量信息的精確手段，因此成為連接分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)研究、功能研究的橋梁，被《老年神經(jīng)生物學(xué)》、《比較神經(jīng)科學(xué)雜志》等國際雜志指定為定量方法。本研究采用體視學(xué)定量方法來評價體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷及氧控制性再灌注的肺保護(hù)作用，與應(yīng)用其他評價方法(髓過氧化物酶、丙二醛等)的意義相同[11]，表明體視學(xué)定量方法評價體外循環(huán)肺損傷具有一定的精確性，但臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

通過體視學(xué)檢測，結(jié)合組織學(xué)評分，發(fā)現(xiàn)在體外循環(huán)再灌注早期即可出現(xiàn)肺損傷表現(xiàn)，而在此階段給予合適的控氧，可以達(dá)到一定的肺保護(hù)目的。但是，臨床的實施需要更加深入的研究。

[1]Egan JR，Butler TL，Cole AD，et al.Myocardial ischemia is more important than the effects of cardiopulmonary bypass on myocrdial water handling and postoperative dysfunction：a pediatric animal model[J].J Thorac Cardiovasc Sur，2008，136(5)：1265-1273.

[2]Munakata H，Okada K，Kano H，，et al.Controlled earlier reperfusion for brain ischemia caused by acute type A aortic dissection.[J].Ann Thorac Surg，2009，87(4)：e27-e28.

[3]Serviddio G，Di Venosa N，F(xiàn)ederici A，et al.Brief hypoxia before normoxic reperfusion(postconditioning)protects the heart against ischemia-reperfusion injury by preventing mitochondria peroxyde production and glutathione depletion[J].FASEB J，2005，19(3)：354-361.

[4]申洪，沈忠英.實用生物體視學(xué)技術(shù)[M].廣州：中山大學(xué)出版社，1991

[5]Arold SP，Mora R，Lutchen KR，et al.Variable tidal volume ventilation improves lung mechanics and gas exchange in a rodent model of acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med，2002，165(3)：366-371.

[6]Manoonkitiwongsa PS，Mcmillan PJ，Schultz RL，et al.A simple stereologic method for analysis of cerebral cortical microvessels using image analysis[J].Brain Res Brain Res Protoc，2001，8(1)：45-47.

[7]Messent M，Sullivan K，Keogh BF，et al.Adult respiratory distress syndrome following cardiopulmonary bypass：incidence and prediction[J].Anesthesia，1992，47(3)：267-268.

[8]Douzinas EE，Patsouris E，Kypriades EM，et al.Hypoxaemic reperfusion ameliorates the histopathological changes in the pig brain after a severe global cerebral ischaemic insult[J].Intensive Care Med，2001，27(5)：905-910.

[9]Douzinas EE， Kollias S， Tiniakos D， et al. Hypoxemic reperfusion after 120 min of intestinal ischemia attenuates the histopathologic and inflammatory response[J].Crit Care Med，2004;32(11)：2279-2283.

[10]Douzinas EE，Livaditi O，Andrianakis I，et al.The effect of hypoxemic resuscitation from hemorrhagic shock on blood pressure restoration and on oxidative and inflammatory responses[J].Intensive Care Med，2008;34(6)：1133-1141.

[11]榮健，王治平，吳鐘凱，等.氧控制性再灌注抗犬體外循環(huán)肺缺血再灌注早期損傷[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2009;30(6)：686-690.