楊 陽(yáng) 陳 雪 李 奕 陳 穎 高銀峰 宋 戈 王曉冬，2*

1(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，南通 226001)

2(南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南通 226001)

引言

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的修復(fù)與再生是世界性的醫(yī)學(xué)難題，目前臨床對(duì)SCI的治療僅局限于早期的藥物治療、手術(shù)干預(yù)治療以及后期的功能恢復(fù)等手段，以期能最大程度減輕癱瘓的程度，并促進(jìn)功能的恢復(fù)[1]。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方面，細(xì)胞移植、人工支架材料移植等方法用于治療SCI已顯示出一定的進(jìn)展。目前細(xì)胞移植的研究主要集中在以下幾種細(xì)胞：施萬(wàn)細(xì)胞[2-3]、神經(jīng)干細(xì)胞[4]、胚胎干細(xì)胞[5]、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow stromal cells，BMSCs)[6-7]、嗅鞘細(xì)胞[8-9]等。其中 BMSCs是來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞，可通過(guò)體外貼壁培養(yǎng)加以分離，具有迅速增殖能力和多向分化潛能。人工支架材料主要為神經(jīng)元的遷移和再生軸突的延伸提供三維引導(dǎo)支架，目前研究的天然可降解性材料主要有膠原、殼聚糖、層黏連蛋白等，其中殼聚糖是天然多糖中唯一大量存在的堿基多糖，毒性低，可降解，與 BMSCs具有良好的相容性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的BMSCs聯(lián)合殼聚糖導(dǎo)管構(gòu)成人工組織移植入大鼠T8脊髓全橫斷損傷模型中，比較各組的修復(fù)效果，探討該手段在治療SCI中的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑及設(shè)備

成年雌性SD大鼠，體重180～200 g用于細(xì)胞培養(yǎng)，體重220～250 g用于動(dòng)物模型制作，均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。IMEM培養(yǎng)基、小鼠抗神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament 200，NF200)抗體、兔抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體、FITC 標(biāo)記的羊抗兔 IgG、TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(Sigma)、胎牛血清(Gibco)、CD11 b-PE抗體、CD45-TRITC抗體、CD90-FITC抗體(Caltag)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、倒置相差顯微鏡(Olympus)、恒冷冰凍切片機(jī)、熒光顯微鏡、QWin圖像分析系統(tǒng)(Leica)、透射電子顯微鏡(Jeol)、MYTO肌電圖儀(Esaote)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)、細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞刮子(Costar)。

1.2 殼聚糖導(dǎo)管的制備

制成外徑2 mm、內(nèi)徑1.8 mm的中空海綿柱狀體，Co60照射消毒后，使用前加入無(wú)菌生理鹽水中漂洗和平衡，備用。

1.3 BMSCs懸液的制備

常規(guī)分離、培養(yǎng)與鑒定 SD大鼠來(lái)源的BMSCs[12]，傳代 2 次后消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度分別為：104個(gè)/mL、106個(gè)/mL、108個(gè)/mL，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中備用。

1.4 動(dòng)物模型制作

復(fù)合麻醉劑腹腔注射麻醉SD大鼠，俯臥位固定，常規(guī)消毒，取后正中切口逐層切開(kāi);咬除T7～T9棘突及相應(yīng)椎板，暴露 T8～T10節(jié)段脊髓，切開(kāi)硬脊膜，將脊髓自T8節(jié)段向遠(yuǎn)端切除2 mm;將殼聚糖導(dǎo)管植入脊髓缺損處，使其與兩側(cè)殘端緊密接觸吻合，用微量進(jìn)液器將BMSCs懸液注入導(dǎo)管內(nèi)，每只大鼠10 μL;逐層縫合切口。大鼠按植入細(xì)胞濃度不同分為3組，每組10只，分別為A組：104個(gè)/mL，B組：106個(gè)/mL，C組：108個(gè)/mL。術(shù)后于腹股溝皮下注射乳酸鹽林格溶液10 mL以補(bǔ)充血容量，肌注青霉素10萬(wàn)單位/kg/d至術(shù)后1周，膀胱按摩4～5次/d，幫助排尿。

1.5 MEP電生理檢測(cè)

術(shù)后12周，各組分別取6只大鼠腹腔麻醉，MTTO肌電圖儀測(cè)定運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(motor evoked potentials，MEP)。刺激電極分別置于頭部、損傷下段(T11)皮下，記錄電極置于腓腸肌內(nèi)。每個(gè)部位重復(fù)刺激3次。

1.6 光鏡標(biāo)本取材及制作

術(shù)后12周，各組分別取8只大鼠腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后取出脊髓組織，經(jīng)4%多聚甲醛后固定24 h，再依次轉(zhuǎn)入10%、20%、30%蔗糖溶液，待組織下沉后取T7～T11脊髓節(jié)段進(jìn)行冰凍切片，橫切，厚度為30 μm，隔5取1進(jìn)行貼片，貼片時(shí)將相同部位的各組切片貼于同一載玻片上。

1.7 一般光鏡觀察

隨機(jī)抽取15張切片，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行尼氏染色后置于顯微鏡下觀察，各組切片任意選2個(gè)視野，對(duì)染色陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.8 雙重免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

隨機(jī)抽取 10張切片，PBS緩沖液洗滌;含0.01%Triton X-100、3%BSA、10% 羊血清的 PBS封閉液37℃，1 h;加小鼠抗NF200抗體(1∶800)和兔抗GFAP抗體(1∶100)，4℃，過(guò)夜;PBS緩沖液洗滌;加 TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(1∶256)和FITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶80)，37℃，2 h，避光;PBS緩沖液洗滌，避光;緩沖甘油封片;熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)中設(shè)不加一抗的空白對(duì)照組。

1.9 電鏡觀察

術(shù)后12周，各組分別取2只大鼠腹腔麻醉，1%多聚甲醛-1.25%戊二醛灌注固定后置入4%戊二醛再固定，1%鋨酸后固定，梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)橫斷超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛復(fù)染，JEM-1230透射電鏡觀察。所獲圖像經(jīng) Leica QWin計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，按 Fine等[13]方法測(cè)量無(wú)髓神經(jīng)纖維數(shù)目、有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及髓鞘厚度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般觀察

大鼠術(shù)后雙后肢癱瘓，身體移動(dòng)依賴(lài)前肢的拖動(dòng);術(shù)后1周內(nèi)活動(dòng)少，煩躁，易受刺激，飲食少，尿儲(chǔ)留，需人工膀胱按摩幫助排尿;術(shù)后4周逐步恢復(fù)自主排尿功能，飲食、活動(dòng)相應(yīng)增加。

2.2 MEP檢測(cè)

圖1 MEP波形圖和直方圖。(a)各組MEP波形圖(@ 刺激皮層時(shí)，#刺激損傷下段時(shí));(b)皮層潛伏期直方圖;(c)皮層振幅直方圖;(d)損傷下段潛伏期直方圖;(e)損傷下段振幅直方圖 (* 與A組相比，P＜0.05，▲與B組相比，P ＜0.05)Fig.1 Oscillograms and histograms of MEP.(a)oscillograms of groups A，B，and C(@oscillograms of MEP by stimulation on the cerebral cortex.#oscillograms of MEP by stimulation on the lower injured site);(b)histograms of the latency period by stimulation on the cerebral cortex;(c)histograms of the amplitude by stimulation on the cerebral cortex;(d)histograms of the latency period by stimulation on the lower injury site;(e)histograms of the amplitude by stimulation on the lower injury site(*P＜0.05 vs group A，▲P＜0.05 vs group B)

術(shù)后12周，各組大鼠在皮層、損傷平面以下刺激時(shí)均能在腓腸肌內(nèi)記錄到MEP(見(jiàn)圖1(a))。在皮層刺激時(shí)，C組的潛伏期與A組相比較短，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖1(b));B組和C組的振幅大于A組，B組的振幅大于 C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖1(c));在損傷平面以下刺激時(shí)，B組和C組的振幅大于A組(P＜0.05)(見(jiàn)圖1(e))。

2.3 脊髓大體觀察

大鼠脊髓灌注取材后，可見(jiàn)各組移植的殼聚糖導(dǎo)管能與脊髓兩殘端達(dá)到良好的整合，在解剖結(jié)構(gòu)上保持良好的連續(xù)性，同時(shí)導(dǎo)管周邊有不透明、明顯增生的結(jié)締組織包裹(見(jiàn)圖2)。

2.4 尼氏染色光鏡觀察

尼氏染色結(jié)果顯示各組導(dǎo)管內(nèi)的再生區(qū)域有陽(yáng)性染色明顯的神經(jīng)元，細(xì)胞胞體清晰，體積較大，密度較低，單位面積內(nèi)尼氏染色神經(jīng)元數(shù)目C組多于A組和 B組(P＜0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖2 脊髓大體觀察照片。(a)原圖;(b)(a)中框內(nèi)局部放大Fig.2 Gross observation of spinal cord.(a)oringinal picture;(b)magnification of the boxed area in the picture(a)

圖3 尼氏染色。(a)A組;(b)B組;(c)C組;(d)尼氏染色神經(jīng)元數(shù)目直方圖 (→ 尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元，標(biāo)尺 =20 μm;* 與 A 組相比，P＜0.05)Fig.3 Nissl's staining.(a)group A;(b)group B;(c)group C;(d)histograms of numbers of Nissl's staining neurons(→ positive neurons of Nissl's staining.Bar=20 μm;* P ＜0.05 vs group A)

2.5 NF/GFAP雙重免疫熒光組織化學(xué)染色

各組脊髓在宿主-移植物交界處(損傷近端)、導(dǎo)管中間段的再生區(qū)域和移植物-宿主交界處(損傷遠(yuǎn)端)界面均可見(jiàn)NF染色陽(yáng)性的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維，其中C組的陽(yáng)性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的數(shù)量相對(duì)較多(見(jiàn)圖4)。

圖4 NF/GFAP雙重免疫熒光組織化學(xué)染色(標(biāo)尺=100 μm，→NF陽(yáng)性神經(jīng)纖維，?NF陽(yáng)性神經(jīng)元)Fig.4 Double fluorescence immunohistochemistry staining of NF and GFAP(Bar=100 μm.→ NF positive nerve fibers.?NF positive neurons)

2.6 電鏡觀察

在各組導(dǎo)管內(nèi)的再生區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)較多的有髓神經(jīng)纖維，髓鞘較厚，形態(tài)規(guī)則，板層結(jié)構(gòu)清晰，電子密度較高，也可見(jiàn)到正在形成中的、結(jié)構(gòu)清晰的新生髓鞘。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，C組的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目多于A組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);C組的髓鞘厚度大于A組和B組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖 5)。

3 討論和結(jié)論

SCI的病理過(guò)程除了脊髓震蕩造成生理性橫斷外，還發(fā)生一系列變化，如受損的脊髓中央灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死，白質(zhì)神經(jīng)纖維軸索出現(xiàn)脫髓鞘，形成小囊腫，繼而融合成大小不等的空腔，最終瘢痕形成，從而阻礙了神經(jīng)細(xì)胞的再生和通過(guò)瘢痕。一般認(rèn)為SCI的修復(fù)必須解決以下問(wèn)題：損傷殘端形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙軸突生長(zhǎng);近端軸突能再生并穿過(guò)宿主-移植物界面;再生軸突需要長(zhǎng)入遠(yuǎn)端脊髓中等[14-15]。本實(shí)驗(yàn)從組織工程學(xué)角度出發(fā)，尋找適合的人工可降解材料殼聚糖導(dǎo)管作為移植的載體，同時(shí)結(jié)合體外分離培養(yǎng)的種子細(xì)胞BMSCs一起構(gòu)成人工組織移植物，植入損傷部位，以達(dá)到修復(fù)損傷脊髓組織結(jié)構(gòu)并重建功能的目的。

BMSCs聯(lián)合殼聚糖導(dǎo)管移植大鼠T8脊髓全橫斷損傷模型12周后，肉眼觀察各組移植的人工支架材料與損傷兩殘端整合良好，材料外有增生的結(jié)締組織包裹，材料內(nèi)有新生組織填補(bǔ)，在解剖學(xué)上達(dá)到了組織結(jié)構(gòu)的連續(xù)性。MEP檢測(cè)是運(yùn)用電刺激皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)產(chǎn)生興奮，通過(guò)下行傳導(dǎo)通路使脊髓前角細(xì)胞去極化，在相應(yīng)肌肉內(nèi)記錄到電位，可為判斷脊髓運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)提供客觀定量的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)術(shù)后12 W實(shí)驗(yàn)各組均能記錄到刺激皮層時(shí)的MEP，說(shuō)明已基本建立了下行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)通路，恢復(fù)了電生理的部分特性，從而為運(yùn)動(dòng)功能的完全恢復(fù)奠定了基礎(chǔ)。其中皮層MEP的潛伏期C組短于A組，振幅B組、C組大于A組，說(shuō)明中、高濃度的細(xì)胞組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)通路恢復(fù)結(jié)果相對(duì)低濃度組好。

圖5 電鏡觀察。(a)A組;(b)B組;(c)C組;(d)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目直方圖;(e)無(wú)髓神經(jīng)纖維數(shù)目直方圖;(f)髓鞘厚度直方圖 (*與A組相比，P＜0.05，▲與 B組相比，P＜0.05)Fig.5 Electron microscopic analysis.(a)group A;(b)group B;(c)group C;(d)histograms of numbers of myelinated nerve fibers;(e)histograms of numbers of unmyelinated nerve fibers;(f)histograms of the thickness of myelin sheath(*P＜0.05 vs group A，▲P＜0.05 vs group B)

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，再生軸突不會(huì)穿越膠質(zhì)瘢痕，更不可能到達(dá)損傷遠(yuǎn)端，尤其是穿越移植物-宿主界面進(jìn)入遠(yuǎn)端脊髓內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)崾先旧Y(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)各組移植物中段均可見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)元，胞體體積飽滿，提示具有一定的再生能力，其中C組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目多于其余兩組。雙重免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)顯示，各組脊髓在橋接近端、遠(yuǎn)端均存在陽(yáng)性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維，它們可能會(huì)穿越膠質(zhì)瘢痕界面、長(zhǎng)入移植物導(dǎo)管內(nèi);在移植物中段的再生區(qū)域內(nèi)能找到少量陽(yáng)性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維，可能是植入的BMSCs在體內(nèi)環(huán)境中分化而來(lái)，也可能是兩斷端殘留的神經(jīng)元、神經(jīng)纖維穿越移植物界面而來(lái)。電鏡結(jié)果顯示，各組再生區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)成熟的神經(jīng)軸突，板層結(jié)構(gòu)清晰，其中C組的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目和髓鞘厚度均大于其余兩組。這說(shuō)明BMSCs聯(lián)合殼聚糖導(dǎo)管移植物能促進(jìn)軸突再生，并可能引導(dǎo)其穿越宿主-移植物界面，到達(dá)脊髓遠(yuǎn)端。BMSCs能分泌多種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)，緩和局部微環(huán)境內(nèi)的抑制因素，從而改善損傷脊髓的再生微環(huán)境;并能在特定的微環(huán)境中分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，達(dá)到補(bǔ)充缺失的脊髓神經(jīng)細(xì)胞的作用，這些可能是高濃度的BMSCs修復(fù)效果較好的原因。殼聚糖導(dǎo)管作為人工組織支架，可以在損傷兩斷端間起橋梁作用，更好地引導(dǎo)軸突再生[16]，這種手段在膠質(zhì)瘢痕形成之初發(fā)揮作用，可能會(huì)適當(dāng)減少損傷導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的形成，從而達(dá)到保護(hù)受損神經(jīng)元、促進(jìn)再生的作用。

綜上所述，高濃度的BMSCs聯(lián)合殼聚糖導(dǎo)管移植可以橋接SCI造成的缺損，促進(jìn)軸突再生和電生理特性的恢復(fù)，達(dá)到較好的修復(fù)效果。今后，考慮在“支架材料+細(xì)胞”的基礎(chǔ)上再輔加生長(zhǎng)因子，制備更完善的“支架材料 +細(xì)胞+生長(zhǎng)因子”的人工組織材料，以期為SCI的治療提供新的思路。

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