張?zhí)K江 李成陽

(1 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300)

(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

微生物蛋白(MCP)是反芻動物重要的蛋白質(zhì)營養(yǎng)來源之一，可滿足動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)需要量的40～80%[1]。研究表明，氨態(tài)氮是合成微生物蛋白質(zhì)的原料，進入羊瘤胃內(nèi)的尿素在微生物的作用下可降解為氨態(tài)氮，進一步被瘤胃微生物合成氨基酸和有機酸而被利用[2]。MCP代謝是瘤胃微生物區(qū)系營養(yǎng)代謝的一個重要的組成部分[3]。

尿素等非蛋白氮類飼料在反芻動物的養(yǎng)殖生產(chǎn)中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，科學(xué)合理地利用尿素等非蛋白氮飼料是解決蛋白質(zhì)飼料來源不足的重要手段之一。適量利用非蛋白氮飼料可以促進反芻動物的生產(chǎn)性能，過量的飼喂非蛋白氮飼料往往會引起動物的中毒。然而，尿素飼喂量對瘤胃MCP含量和原蟲數(shù)量的影響鮮見報道。本研究以常用的非蛋白氮飼料尿素為材料，通過羊瘤胃液體外發(fā)酵的方法，探討尿素水平對瘤胃發(fā)酵液MCP含量和原蟲數(shù)量的影響，以期為尿素飼料的安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

尿素的濃度設(shè)置為6組，分別占底物基礎(chǔ)飼料的0%、1%、2%、3%、4%和5%，每個濃度設(shè)3個重復(fù)樣。使用100 ml玻璃注射器作為發(fā)酵管，每個發(fā)酵管中裝取人工瘤胃液20 ml，底物2 g。體外發(fā)酵使用水浴搖床進行體外發(fā)酵，基礎(chǔ)飼料組成見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成

1.2 儀器設(shè)備與瘤胃液

儀器設(shè)備:精料配合飼料、發(fā)酵管、水浴搖床、消化爐、消化管、全自動凱氏定氮儀、顯微照相儀、血細胞計數(shù)板、保溫杯等。

瘤胃液:瘤胃液采自體重30kg左右、安裝有永久瘤胃瘺管的卡拉庫爾羊。實驗于2010年11月至2011年1月在塔里木大學(xué)生物研發(fā)中心進行。

1.2.1 人工瘤胃液配制

1.2.1.1 微量元素液A:稱取氯化鈣13.2 g、氯化錳10.0 g、氯化鈷1.0 g、氯化鐵8.0 g，加入到200 ml的燒杯中，加蒸餾水攪拌，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移到1 000 ml的容量瓶中，加蒸餾水定容到1 000 ml。

1.2.1.2 緩沖溶液B:4.0 g碳酸氫銨和35 g碳酸氫鈉加蒸餾水定容到1 000 ml。

1.2.1.3 常量元素C:5.7 g磷酸氫二鈉、6.2 g磷酸二氫鉀和0.6 g七水硫酸鎂加蒸餾水定容到1 000 ml。

1.2.1.4 還原液D:氫氧化鈉，0.625 0 g硫化鈉加水至95 ml。

1.2.2 瘤胃液體外發(fā)酵

1.2.2.1 在培養(yǎng)前，配制瘤胃培養(yǎng)液。將400 ml蒸餾水，0.1 ml溶液A，200 ml溶液B和200溶液C，40 ml還原液D配合在一起，放在39℃的水浴鍋中，然后通入二氧化碳半個小時，并用玻璃棒不斷攪動培養(yǎng)液。

1.2.2.2 瘤胃液采集，通過羊瘤胃瘺管采集瘤胃液，置于保溫杯中迅速的帶回實驗室，在培養(yǎng)液通二氧化碳半個小時后，將瘤胃液倒在4層的紗布過濾，濾出液相部分約200 ml，在將瘤胃過濾液與培養(yǎng)液按1:2(V:V)的比例配制人工瘤胃液，倒入容積為1 L的大燒杯中，將大燒杯放在39℃的水浴鍋中持續(xù)通二氧化碳氣體。

1.2.2.3 準備容量為100 ml玻璃注射器作為體外發(fā)酵管，最小的刻度為1 ml，注射器的前端要套上3～5 cm的軟質(zhì)橡皮管，以起到密封作用。

1.2.2.4 準確稱取0.200 0 g飼料樣品，再按飼料樣品的重量分別稱取占重量百分比的0%，1%，2%，3%，4%，5%的尿素。加入到飼料樣品中，將樣品緩慢倒入到發(fā)酵管的最前端。

1.2.2.5 緩慢將20 ml人工瘤胃液吸入到玻璃注射器中，再將發(fā)酵管中的空氣排盡后，把注射器前端的軟質(zhì)橡皮管打結(jié)。

1.2.2.6 將所有的發(fā)酵管放入到水浴搖床中之后開始振蕩發(fā)酵，水浴搖床的溫度設(shè)置在39℃。

1.2.2.7 在實驗過程中分別取發(fā)酵6 h，12 h和24 h后的發(fā)酵液進行原蟲的計數(shù)工作。

1.2.3 瘤胃原蟲測定

1.2.3.1 取發(fā)酵過的瘤胃培養(yǎng)液15 ml，用雙層紗布濾去殘渣，再取濾液1 ml，加入原生質(zhì)染色液(MFS)4 ml(MFS:35%的福爾馬林100 ml，NaCl 8.0 g，甲基綠0.6 g和蒸餾水900 ml)，混勻后靜置染色半小時。原蟲蟲體細胞質(zhì)不被MFS染色，細胞核則染為藍綠色。

1.2.3.2 用吸管吸取樣品稀釋液，緩慢滴加到血球計數(shù)室，蓋上蓋玻片，放在光學(xué)顯微鏡下鏡檢(100X)。每個樣品取10個視野。每個視野取10個方格，最后取平均數(shù)。

1.2.3.3 計算方法:原蟲數(shù)/ml=X/S×D×2×1000

X:所觀察的所有方格中原蟲的總數(shù)

S:計數(shù)的方格數(shù)

D:稀釋倍數(shù)(本實驗的稀釋倍數(shù)為5倍)

1.3 瘤胃液MCP的測定

1.3.1 試劑

濃硫酸(98%)、混合催化劑(0.4 g硫酸銅，6 g硫酸鉀或硫酸鈉，磨碎混勻)、飽和NaOH溶液、2%硼酸、甲基紅溴甲酚綠混合指示劑、0.1 mol/L鹽酸標準溶液、硫酸銨。

1.3.2 MCP測定

1.3.2.1 取發(fā)酵24 h的人工瘤胃液20 ml加入到容量為50 ml潔凈的離心管中進行離心，離心機轉(zhuǎn)速為1 500 rpm，溫度為4℃，離心20 min。

1.3.2.2 離心20 min后，取20 ml所得上清液裝入容量為50 ml潔凈的的離心管中(所放相對離心位置的兩個離心管重量要配平)，放入離心機中進行離心。離心機轉(zhuǎn)速設(shè)定:20 000 rpm，溫度為4℃，離心20 min。

1.3.2.3 離心20 min后，棄去上清液，再用生理鹽水沖洗離心管中的沉淀物，直到粘在離心管內(nèi)壁的完全沉淀物脫落，所得沖洗液轉(zhuǎn)移到裝入容量為50 ml潔凈的離心管中，再次離心(離心機轉(zhuǎn)速20 000 rpm，溫度為4℃)離心20 min。

1.3.2.4 將離心好的細胞沉淀無損的移到濾紙上，并放到烘箱中干燥6 h，烘箱溫度設(shè)置為130℃(干燥前要先記錄濾紙的重量)。樣品干燥后稱重。

1.3.2.5 樣品蛋白質(zhì)的測定按凱氏定氮法測定。樣品經(jīng)完全消煮后，用全自動凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進行整理后，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及多重比較。顯著檢驗水平為0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度尿素對瘤胃MCP的影響

表2 不同濃度尿素對瘤胃MCP的影響

由表1可知，MCP含量在2%和3%尿素濃度時最高，顯著高于其它各組(P＜0.05)，但2%和3%尿素濃度組之間無顯著差異(P＞0.05)。4%和5%的尿素添加濃度MCP含量最低，顯著低于未加尿素組和1%的尿素添加組。未添加尿素組和1%的尿素添加組，MCP含量處于同一水平，未

2.2 不同濃度尿素對瘤胃原蟲數(shù)量的影響

見有顯著差異(P＞0.05)。此外，表中數(shù)據(jù)還顯示，尿素添加濃度在0%～3%個范圍內(nèi)，MCP含量隨著尿素濃度的增加而增加;尿素添加濃度在3%～5%范圍內(nèi)，MCP含量則隨著尿素濃度的增加而減少。

表3 不同濃度尿素對瘤胃6 h，12 h，24 h原蟲數(shù)量的影響(×104/mL)

由表3可見:原蟲數(shù)量在尿素濃度為2%和3%時顯著大于其它尿素組(P＜0.05)，原蟲數(shù)量在尿素濃度2%和3%之間無顯著差異(P＞0.05)。未添加尿素組和1%尿素濃度組間原蟲數(shù)量在同一水平，差異不顯著(P＞0.05)，但二者的原蟲數(shù)量均顯著高于4%和5%的尿素水平添加組。在尿素濃度為0%、1%、2%和3%范圍內(nèi)，原蟲的數(shù)量隨尿素濃度水平增加而增加，之后，原蟲濃度則隨尿素添加濃度的增加而減少。發(fā)酵液原蟲在4%和5%的尿素濃度下數(shù)量最少。此外，瘤胃原蟲數(shù)量隨發(fā)酵時間的增加而表現(xiàn)出了下降趨勢。

3 討論

3.1 尿素對瘤胃MCP含量人影響

實驗結(jié)果表明，尿素濃度為3%的發(fā)酵組中MCP的含量最高，達到了1.82 mg/ml，而未加尿素對照組中MCP的含量是1.14 mg/ml，3%尿素濃度組較對照組發(fā)酵液中MCP的含量上升了59%，尿素濃度為5%發(fā)酵組MCP的含量最低是0.68 mg/ml，比對照組MCP下降了40%左右;在尿素濃度為0%，1%，2%，3%時，MCP含量隨尿素含量的增加而增加。這一結(jié)果說明，一方面，飼料中添加一定量的尿素水平有利于發(fā)酵液瘤胃微生物的增殖，進而使MCP的含量有顯著增加;另一方面，尿素添加濃度在4%和5%的水平，則對發(fā)酵液瘤胃微生物的增殖表現(xiàn)出了負面作用，這很可能是過高的尿素添加量會產(chǎn)生較多的氨態(tài)氮，使發(fā)酵液的pH環(huán)境發(fā)生了不利于瘤胃微生物增殖的變化而使其數(shù)量減少，致使MCP含量下降所致。研究表明，飼料中尿素的添加量控制在一定的濃度對MCP的合成量起促進作用，尿素在瘤胃內(nèi)經(jīng)過瘤胃內(nèi)微生物的降解產(chǎn)生氨基酸、氨氮和有機酸等[4，5]。尿素使用量過多會使尿素降解產(chǎn)生的氨氮濃度上升，較高濃度的氨氮會存留在瘤胃內(nèi)或進入血液中，使瘤胃內(nèi)和血液中的pH值上升[6]，間接使瘤胃內(nèi)脲酶的活性受到抑制，使瘤胃微生物對瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮的利用受阻，進而使MCP的合成量受到抑制[7]。當粗飼料中蛋白質(zhì)來源不足時，添加一定量的非蛋白氮可顯著改善瘤胃內(nèi)MCP的代謝[8]，這些研究結(jié)果與本實驗的結(jié)果一致。

3.2 尿素濃度與瘤胃原蟲數(shù)量的關(guān)系

發(fā)酵液瘤胃原蟲數(shù)量的變化規(guī)律與MCP的變化規(guī)律基本一致。一般認為，原蟲對提高宿主氮的利用率和生長具有積極的促進作用[9]。原蟲自身不能利用尿素分解的氨態(tài)氮合成蟲體蛋白，而是通過原蟲吞噬細菌獲取蛋白(間接利用尿素氮)，被瘤胃原蟲吞噬的細菌則可以利用尿素降解產(chǎn)生的氨合成細菌蛋白，合成的細菌蛋白又被原蟲利用來進行自身的生長和繁殖[10]。尿素添加濃度小于3%時，發(fā)酵液細菌的數(shù)量會隨尿素濃度的增加而增加，加快了瘤胃細菌的生長，這為原蟲的生長和增殖提供了更多的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而使原蟲的數(shù)量有明顯增加。有研究表明羊瘤胃細菌和原蟲數(shù)量之間存在正相關(guān)關(guān)系[11];艾曉杰等[12]人觀察了一種含銨的工業(yè)廢液(ISCA)作為非蛋白氮飼料對瘤胃蛋白質(zhì)代謝的影響，結(jié)果也顯示非蛋白氮可以同步增加瘤胃細菌和原蟲數(shù)量。這些研究結(jié)果為以上推理提供了有力的佐證。相似的原因，當尿素濃度增加至4%和5%時，發(fā)酵液中瘤胃細菌數(shù)量受到過量氨態(tài)氮的毒害作用而減少，發(fā)酵液中瘤胃原蟲的數(shù)量則很可能因為吞噬細菌數(shù)量的減少，其生長和增殖受到抑制，數(shù)量顯著減少。至于瘤胃原蟲數(shù)量隨發(fā)酵時間的增加而表現(xiàn)出下降趨勢，其原因很可能是，隨著發(fā)酵液在體外發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵過程產(chǎn)生了過多的不利于瘤胃微生物增殖有害物質(zhì)造成的。

4 結(jié)論

尿素濃度在0～3%范圍內(nèi)，MCP和原蟲數(shù)量均表現(xiàn)出隨尿素濃度增加而增加，2%和3%尿素濃度時，MCP和原蟲數(shù)量均較高，顯著高于1%和對照組，說明此濃度可促進瘤胃微生物的增殖;但是，MCP和原蟲數(shù)量在尿素濃度為4%和5%時均有顯著下降，說明尿素濃度過大則對瘤胃微生物表現(xiàn)出了明顯的毒害作用。

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