任曉鏷 陳 偉，2* 張利莉

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300)

(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300)

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)作為一種條件致病菌，其生物膜形成(biofilm formation，BF)是重要的致病因子之一。同時(shí)由于形成生物膜，抗生素藥物無(wú)法殺死膜內(nèi)部的病原菌，導(dǎo)致所致疾病的反復(fù)發(fā)作且難以治愈，如醫(yī)院院內(nèi)感染和奶牛乳房炎[1]。與生物膜形成有關(guān)的基因種類很多，導(dǎo)致來(lái)源不同的表皮葡萄球菌生物膜形成機(jī)制并不相同，因此從基因水平了解生物膜形成機(jī)制顯得尤為重要。

奶牛乳房炎是一種由病原微生物引起的奶牛泌乳系統(tǒng)疾病，該疾病嚴(yán)重制約著奶牛業(yè)的健康發(fā)展。在引起奶牛乳房炎的復(fù)雜病原菌中，表皮葡萄球菌的分離率達(dá)50%。本研究檢測(cè)了分離自新疆南疆奶牛場(chǎng)隱性乳房炎乳樣的表皮葡萄球菌其生物膜形成表型及相關(guān)基因，為該地區(qū)表皮葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎防制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀(Bio－Rad)，96孔板(Labphil)，恒溫培養(yǎng)箱(上海)，移液器(Eppendorf)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自Takara公司，實(shí)驗(yàn)所需引物均由上海生工合成，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基，BactoTM)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 35984(BF+，ica+)、ATCC12228(BF－，ica－)由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送，其它表皮葡萄球菌均由本實(shí)驗(yàn)室從當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)采樣分離鑒定后獲得。

1.4 表皮葡萄球菌生物膜形成檢測(cè)

根據(jù)Christensen等的方法[2]并略做改動(dòng)。按1:100的接種比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液30μl，接種至3 ml培養(yǎng)基中，振蕩搖勻后，吸取200μl至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每株接種6孔。每一培養(yǎng)板中同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(ATCC 35984)、陰性對(duì)照(ATCC 12228)與空白對(duì)照(等體積的TSB培養(yǎng)基)各6孔。37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，輕輕拍出培養(yǎng)液，無(wú)菌水洗板4次，每次振搖30下左右，洗去未粘附細(xì)菌。56℃烘干固定1 h，50μl 0.5%結(jié)晶紫染色5 min，自來(lái)水沖洗除去多余染液，37℃晾干，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的OD值。所有生物膜形成檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)3次。

1.5 表皮葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因PCR檢測(cè)

1.5.1 ica的檢測(cè)

[3]設(shè)計(jì)胞間多糖黏附素基因ica(intercellular adhesion，ica)基因座部分片段引物序列，icaAB－F－Se:5’－TTA TCA ATG CCG CAG TTG TC－3’，icaAB－R－Se:5’－GTT TAA CGC GAG TGC GCT AT－3’，預(yù)期片段長(zhǎng)度為546 bp。擴(kuò)增條件:94℃，5 min;94℃，30 s;55℃，1 min;72℃，40 s，30個(gè)循環(huán);72℃，10 min。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5.2 ica非依賴型生物膜形成相關(guān)基因的檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[4－6]選擇5個(gè)與表皮葡萄球菌生物膜形成有關(guān)的基因，并設(shè)計(jì)引物(見表1)。

表1 非ica依賴型生物膜形成相關(guān)基因

PCR擴(kuò)增條件為:95℃，5 min;95℃，30 s;55℃，30 s;72℃，1 min;30個(gè)循環(huán);72℃，10 min。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果和分析

2.1 表皮葡萄球菌生物膜形成的檢測(cè)

通過(guò)微量板半定量法對(duì)從當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)隱性乳房炎陽(yáng)性乳樣中分離出的54株表皮葡萄球菌進(jìn)行生物膜形成檢測(cè)，結(jié)果表明其中有22株表皮葡萄球菌能形成不同程度的生物膜，占所檢測(cè)表皮葡萄球菌的41.1%。這說(shuō)明在當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)能形成生物膜的乳房炎表皮葡萄球菌已經(jīng)占了相當(dāng)大的比例，需引起足夠重視。尤其是在臨床治療奶牛乳房炎時(shí)，應(yīng)該按照治療生物膜相關(guān)感染的策略，加大抗生素劑量，延長(zhǎng)治療周期，徹底殺死病原菌[1]。

2.2 ica基因座在所分離表皮葡萄球菌的存在情況

檢測(cè)了56株表皮葡萄球菌ica基因座的分布情況，未發(fā)現(xiàn)該基因座存在于所分離的表皮葡萄球菌中。該結(jié)果表明分離自本地區(qū)的奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌不含有ica基因座。而這些不含ica基因座且又能形成生物膜的表皮葡萄球菌，其生物膜形成機(jī)制屬于ica非依賴性。

2.3 ica非依賴型生物膜形成相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)56株分離得到的表皮葡萄球菌進(jìn)行aap、bhp、atlE、sarA、fbe5個(gè)基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明不同株的表皮葡萄球菌含有的不同基因，其生物膜形成能力也有差異，具體結(jié)果見表2。其中4株含有bhp基因的表皮葡萄球菌有3株能形成程度不同的生物膜，而18株含有sarA基因的表皮葡萄球菌只有8株能形成生物膜，且生物膜形成強(qiáng)陽(yáng)性臨床分離菌株5－125－C含有aap基因，5－65－1含有fbe基因。

表2 PCR擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 表皮葡萄球菌生物膜形成過(guò)程

表皮葡萄球菌生物膜形成主要包括兩個(gè)階段:表皮葡萄球菌的初始黏附階段和聚集階段。初始黏附(Primary attachment)即細(xì)菌直接或與宿主體內(nèi)的基質(zhì)蛋白等因子作用間接附著在生物材料表面的過(guò)程。這一階段有很多相關(guān)因子的參與，如自溶素蛋白AtlE(Autolysin AtlE)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白Fbe(Fibrinogen binding protein，F(xiàn)be)和葡萄球菌表面蛋白(Staphyloccal surface protein，Ssp1)等。其中atlE基因編碼1335個(gè)氨基酸的AtlE蛋白，分子量約為148kD，AtlE表達(dá)于細(xì)胞表面，包含60kD和53kD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別具有酰胺酶和氨基葡糖苷酶功能，60kD蛋白在黏附過(guò)程中可能具有中要作用。另一重要基因?yàn)閒be，編碼纖維原結(jié)合蛋白，分子量約為119kD，為纖維蛋白原配體[7]。另外也有文獻(xiàn)指出，atlE基因編碼的AtlE蛋白，具有黏附纖連蛋白(vitronectin，Vn)活性，可以促使表皮葡萄球菌與宿主蛋白包被的生物材料結(jié)合。但AtlE蛋白并非直接介導(dǎo)黏附，而是通過(guò)釋放胞外DNA在生物膜形成過(guò)程中起作用，特異性的AtlE抗血清并不能阻止表皮葡萄球菌的黏附;而Fbe蛋白，可能與宿主的纖維蛋白原(Fg)結(jié)合，介導(dǎo)表皮葡萄球菌黏附于生物材料的表面，從而促使生物膜形成，與表皮葡萄球菌的致病性有一定關(guān)系[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，atlE基因和fbe基因的檢出率分別為55%和50%，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明在生物膜的形成過(guò)程中可能還需要這些基因的共同作用才能使這兩個(gè)基因發(fā)揮相應(yīng)作用。

細(xì)菌在生物材料表面初始附著后，即調(diào)整其基因表達(dá)，在生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)分泌大量胞外多糖(Exopolysacchride，EPS)。EPS可粘結(jié)單個(gè)細(xì)菌而形成細(xì)菌團(tuán)塊，即微菌落(Microcolony)。EPS的主要成分是胞間多糖粘附素，由ica基因座控制表達(dá)。大量微菌落使生物膜加厚，因此EPS分子的產(chǎn)生對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的發(fā)展十分重要[9，10]。在聚集階段，表皮葡萄球菌之間相互連接從而形成生物膜。它需要聚集相關(guān)蛋白AAP及生物膜形成相關(guān)蛋白BHP的參與。有報(bào)道稱在表皮葡萄球菌中有aap和bhp存在，而沒有ica基因座存在時(shí)，在環(huán)境因素的影響下菌株可以形成生物膜，但形成能力很弱;bhp的表達(dá)受葡萄糖調(diào)控，在葡萄糖存在時(shí)，可誘導(dǎo)表達(dá)引起菌體的凝集[4]。因此可以說(shuō)bhp具有彌補(bǔ)PIA缺乏而形成生物膜的功能。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有1株菌同時(shí)含有aap基因和bhp基因，而其生物膜形成為強(qiáng)陽(yáng)性，這也在一定程度上對(duì)此結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證。

3.2 表皮葡萄球菌生物膜形成機(jī)制

影響生物膜形成的因素有多種，可將按其形成是否依賴胞間多糖粘附素形成機(jī)制可分為兩類:ica依賴型和ica非依賴型[11]。ica依賴型的形成機(jī)制是指生物膜的形成需要于ica基因座的編碼產(chǎn)物PIA得，而ica非依賴型的形成機(jī)制是指生物膜的形成過(guò)程沒有ica基因座編碼產(chǎn)物的介導(dǎo)，是由其它眾多調(diào)控因子共同作用形成的。目前研究較多的ica非依賴型的生物膜形成相關(guān)基因有聚集相關(guān)蛋白(accumulation－associated protein，aap)、生物膜相關(guān)蛋白類似物(biofilm－associated protein homologue protein，bhp)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白(fibrinogen binding protein，fbe)、自溶素E(autolysin E，atlE)和葡萄球菌附屬調(diào)節(jié)蛋白A(staphylococcal accessory regulator A，sarA)等[11－15]。

有學(xué)者證明ica非依賴型的生物膜可能是一種在抗生素壓力下形成的“不完全”生物膜[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然檢測(cè)出22株生物膜形成菌株，但與含有ica基因座的表皮葡萄球菌AICC35984相比，形成的生物膜粘附力不夠。這也說(shuō)明ica基因座編碼產(chǎn)生的PIA是生物膜形成的重要物質(zhì)，能使細(xì)菌牢固粘附在固相表面上。

從本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果看，目前新疆南疆地區(qū)奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌的生物膜形成機(jī)制均為ica非依賴型。由于所選的基因有限，在分離的菌株中有一些能夠形成生物膜，但卻未能擴(kuò)增出所選的5個(gè)基因之一。另一方面，仍有50%以上的菌株能夠擴(kuò)增出所選基因，但其生物膜形成卻表現(xiàn)為陰性。這些結(jié)果的出現(xiàn)更進(jìn)一步說(shuō)明了ica非依賴型生物膜形成機(jī)制的復(fù)雜性，還存在其他眾多的調(diào)控機(jī)制調(diào)控生物膜的形成。這種復(fù)雜性給新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜感染的防制帶來(lái)困難。

綜上所述，表皮葡萄球菌生物膜的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，闡明生物膜形成機(jī)制，制定針對(duì)生物膜感染的有效措施，可能是新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎防制的關(guān)鍵。本研究結(jié)果為新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎的防制奠定了理論基礎(chǔ)。

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