趙 娟 王立浩 毛勝利 張正海 云興福 張寶璽*

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010019）

近年來，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）對(duì)辣椒（Capsicumm annuumL.）的危害日益嚴(yán)重，其主要通過蚜蟲進(jìn)行傳播，可引起辣椒系統(tǒng)花葉、矮化、皺縮，導(dǎo)致果實(shí)畸形，嚴(yán)重減產(chǎn)（Xu & Barnett，1983）。培育抗黃瓜花葉病毒的辣椒新品種是辣椒育種的目標(biāo)之一（張寶璽 等，2005）。分子標(biāo)記技術(shù)的成熟為輔助辣椒抗病育種提供了條件，可通過基因定位構(gòu)建遺傳圖譜，在此基礎(chǔ)上分離克隆抗病基因，進(jìn)一步了解病害的發(fā)生機(jī)制（張麗英 等，2008）。

辣椒分子標(biāo)記和數(shù)量遺傳的研究近年逐步發(fā)展起來，國(guó)外研究者采用RFLP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)得到了一些辣椒抗黃瓜花葉病毒的QTL位點(diǎn)（Caranta et al.，1997；Ben Chaim et al.，2001；Caranta et al.，2002），國(guó)內(nèi)研究者在辣椒抗疫?。ò察o 等，2007）、辣椒紅素含量（張芳芳 等，2010）的QTL定位方面取得一定進(jìn)展。但關(guān)于辣椒抗黃瓜花葉病毒QTL定位的研究鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)采用SRAP和SSR分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建辣椒分子遺傳圖譜，針對(duì)辣椒抗黃瓜花葉病毒基因進(jìn)行QTL定位分析，以期為今后辣椒抗黃瓜花葉病毒育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯菲贩N perennial，抗黃瓜花葉病毒，果實(shí)指形，朝天，味辣，從法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)；甜椒品種茄門，感黃瓜花葉病毒，果實(shí)燈籠形，主要園藝性狀優(yōu)良，來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。

試驗(yàn)于 2008年 3～11月在本所進(jìn)行。采用抗病材料 perennial和感病材料茄門雜交的 F2為作圖群體，共146株。F2自交得到F3，共146個(gè)株系，每個(gè)株系3次重復(fù)，每處理10株，共4 380株。

2008年3月播種雙親以及F2群體的146個(gè)單株；9月播種雙親以及F3株系，每個(gè)苗盤種植6行，每行10株，F(xiàn)3每個(gè)株系種植30株，以75-3-1為感病對(duì)照，進(jìn)行室內(nèi)人工接種抗病性鑒定。

1.2 分子標(biāo)記篩選

采用CTAB小量法（Fulton et al.，1995）提取雙親、F2的146個(gè)單株葉片DNA。SRAP分子標(biāo)記引物參考 Li和 Quiros（2001）、Riaz等（2001）、Lin等（2003）、Budak等（2004）、王剛等（2004）、雷劍和柳?。?006）等。SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系參考 Li和 Quiros（2001）的方法。SSR分子標(biāo)記引物參照Sol genomics network上公布的引物（http://solgenomics.net/），共150對(duì)（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），利用親本進(jìn)行引物的篩選。SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系參照Tam等（2005）的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物在4%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳、銀染。將銀染后晾干的膠板放置于白光燈箱上，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶，與母本茄門帶型相同記為a，與父本perennial帶型相同記為b，具有共顯性的帶型記為h，由于各種原因造成的數(shù)據(jù)不清晰或缺失者記為“-”。在SRAP標(biāo)記中，F(xiàn)2出現(xiàn)與母本不同的記為c，與父本不同的記為d。

1.3 抗病性鑒定

本試驗(yàn)采用的黃瓜花葉病毒為重花葉株系，該病毒由本所病毒真菌課題組提供。在防蟲溫室中，待幼苗 3～4片真葉時(shí)采用人工摩擦接種法（孫秀東 等，2008）進(jìn)行接種。接種前，要保證幼苗的生長(zhǎng)整齊一致。以75-3-1為感病對(duì)照。取已感染黃瓜花葉病毒的三生煙（Nicotiana tobacumcv.Samsun NN）鮮葉，按照鮮葉與0.03 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH=8.0）1M∶5V混合。在冰浴中研磨成勻漿，離心過濾得到接種液，接種液現(xiàn)配現(xiàn)用。接種前在辣椒真葉上灑少許過600目篩金剛砂，然后用手指蘸取接種液輕輕摩擦葉面，接種第1、2真葉。接種后用水沖掉葉面上多余的汁液。接種后溫度控制在25～30 ℃。第1次接種3 d后進(jìn)行第2次接種，保證所有單株均接有該病毒。接種20 d后調(diào)查發(fā)病癥狀。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家“八五”辣椒抗病育種攻關(guān)組的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（李樹德，1995）：0級(jí)，無任何癥狀；1級(jí)，心葉明脈或接種葉急性小枯斑；3級(jí)，系統(tǒng)花葉或莖上產(chǎn)生壞死斑點(diǎn)；5級(jí)，系統(tǒng)重花葉、畸形或莖上產(chǎn)生壞死條斑；7級(jí)，多數(shù)葉片畸形、蕨葉、植株矮化或莖、枝和葉脈系統(tǒng)壞死；9級(jí)，植株嚴(yán)重矮化，停止生長(zhǎng)或嚴(yán)重系統(tǒng)壞死，至全株死亡。群體抗病類型劃分標(biāo)準(zhǔn)參考孫秀東等（2008）的方法，免疫（I）：病情指數(shù)=0；高抗（HR）：病情指0.1～5.0；抗?。≧）：病情指數(shù)5.1～20.0；耐?。∕R）：病情指數(shù)20.1～40.0；感?。⊿）：病情指數(shù)大于40.0。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)孔繁玲（2006）的世代對(duì)比法計(jì)算F2群體的廣義遺傳力。結(jié)合SRAP和SSR分子標(biāo)記在 F2上的多態(tài)性，采用 JoinMap3.0軟件構(gòu)建連鎖遺傳圖譜，取 LOD＞3.0。參照 Ben Chaim等（2001）的方法，將遺傳圖譜的數(shù)據(jù)結(jié)合辣椒抗黃瓜花葉病毒的接種鑒定結(jié)果，運(yùn)用MapQTL4.0軟件中的Permutation Test功能，計(jì)算并確定連鎖群的LOD值；利用Composite Interval Mapping功能即復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL分析，并分析QTL的加性效應(yīng)，解釋表型變異的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP、SSR分子標(biāo)記多態(tài)性

篩選出有差異的SRAP引物426對(duì)，選擇擴(kuò)增多態(tài)性譜帶較清晰，且在父母本間表現(xiàn)差異明顯的SRAP引物35對(duì)，在F2群體上進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，得到83個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，平均每對(duì)引物可以擴(kuò)增出 2條明顯的差異譜帶。其中引物Bm8F×K2R在 F2群體上部分單株的多態(tài)性見圖1。

圖1 引物Bm8F×K2R在F2群體上的多態(tài)性分析

篩選出有差異的SSR引物56對(duì)，選擇擴(kuò)增多態(tài)性譜帶較清晰，且在父母本間表現(xiàn)差異明顯的SSR引物36對(duì)，在F2群體上進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。其中引物SSR088在F2群體上部分單株的多態(tài)性見圖2。

2.2 抗黃瓜花葉病毒鑒定結(jié)果

從 F3群體的表現(xiàn)來看，各株系間差異明顯（圖3）。父本perennial整體無明顯感病癥狀，僅個(gè)別葉片上產(chǎn)生枯斑；母本茄門感病癥狀明顯，出現(xiàn)花葉、矮化、條斑，部分單株甚至死亡；F1的感病癥狀介于親本之間，有枯斑和花葉出現(xiàn)（圖4）。

圖2 引物SSR088在F2群體上的多態(tài)性分析

圖3 F3群體接種黃瓜花葉病毒的發(fā)病情況

圖4 父母本及F1接種黃瓜花葉病毒的發(fā)病情況

將F3群體抗病鑒定的病情指數(shù)取平均值來反映F2世代146個(gè)單株的抗病性（Ben Chaim et al.，2001），就是利用擴(kuò)大接種鑒定的群體數(shù)量來提高鑒定F2抗性的準(zhǔn)確性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，F(xiàn)3群體中沒有對(duì)黃瓜花葉病毒免疫的株系，病情指數(shù)在5.1～20.0之間的抗?。≧）株系25個(gè)，病情指數(shù)在20.1～40.0之間的耐?。∕R）株系109個(gè)，病情指數(shù)大于 40.0的感?。⊿）株系 12個(gè)。其中父本perennial的病情指數(shù)為4.44，是對(duì)CMV高抗的品種，而母本茄門和感病對(duì)照75-3-1的病情指數(shù)分別為51.11、59.84，均遠(yuǎn)大于40.0。

由圖5可以看出，F(xiàn)3株系抗黃瓜花葉病毒病情指數(shù)分布呈正態(tài)分布，可用于數(shù)量性狀的定位分析。

圖5 F3株系抗黃瓜花葉病毒病情指數(shù)分布圖

2.3 廣義遺傳力分析

如表1所示，辣椒抗黃瓜花葉病毒病的廣義遺傳力不高，僅為 45.47%，說明抗性可能受到多個(gè)基因控制，同時(shí)環(huán)境因素對(duì)黃瓜花葉病毒病的抗性表現(xiàn)有較大影響，在進(jìn)行抗病育種時(shí)應(yīng)放寬選擇標(biāo)準(zhǔn)。

表1 F2的廣義遺傳力

2.4 分子遺傳圖譜和QTL定位

利用SRAP分子標(biāo)記得到83個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，結(jié)合36個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記，應(yīng)用JoinMap3.0軟件進(jìn)行連鎖分析，取LOD值為3.0，得到的分子連鎖圖譜包括13個(gè)連鎖群、76個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，其中SRAP標(biāo)記55個(gè)，SSR標(biāo)記21個(gè)。圖譜覆蓋長(zhǎng)度為830.4 cM，標(biāo)記間平均圖距為10.92 cM，連鎖群上的標(biāo)記數(shù)在2～16之間，長(zhǎng)度處于0～152.2 cM范圍內(nèi)（圖6）。經(jīng)QTL分析，在第1、4、7連鎖群上檢測(cè)到3個(gè)QTL位點(diǎn)（表2）。第1連鎖群上的QTL位點(diǎn)的LOD值為3.78，在連鎖群上支持的區(qū)域?yàn)?36.1～146.1 cM，與其距離最近的兩個(gè)標(biāo)記是C9C10-4、B11C16-2，可解釋表型差異的貢獻(xiàn)率為12.7%；在第4連鎖群上的QTL位點(diǎn)LOD值為3.35，在連鎖群上支持的區(qū)域?yàn)?7.0～62.0 cM，與其距離最近的標(biāo)記為B13C10、HpmsE072；在第7連鎖群上檢測(cè)到的QTL位點(diǎn)在HpmsE124和hpms2-2兩個(gè)標(biāo)記之間，其LOD值為3.73，支持區(qū)域?yàn)?4.3～109.3 cM；后2個(gè)QTL的解釋表型差異的貢獻(xiàn)率分別為38.8%和11.0%。

圖6 辣椒抗黃瓜花葉病毒分子遺傳連鎖圖譜

表2 辣椒抗黃瓜花葉病毒QTL分析

3 結(jié)論與討論

國(guó)外對(duì)于辣椒抗黃瓜花葉病毒的QTL定位的研究取得了一些成果。Caranta等（1997）通過構(gòu)建辣椒遺傳圖譜結(jié)合對(duì)F1抗病性鑒定，找到3個(gè)有關(guān)辣椒抗CMV的QTL位點(diǎn)，解釋的表型變異在57%以上。之后又利用復(fù)合區(qū)間作圖法在新的親本組合中找到8個(gè)抗CMV的QTL位點(diǎn)，其中1個(gè)主效QTL解釋的表型變異為45.0%～63.6%（Carahta et al.，2002）。Ben Chaim等（2001）在由180個(gè)F3世代單株為作圖群體構(gòu)建辣椒遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，采用區(qū)間作圖法對(duì)辣椒抗CMV進(jìn)行定位研究，得到4個(gè)QTL位點(diǎn)，其中1個(gè)主效QTL解釋的表型變異為16%～33%。

本試驗(yàn)采用復(fù)合區(qū)間作圖法得到3個(gè)QTL位點(diǎn)，分布在3個(gè)連鎖群上，能解釋表型變異率分別為 12.7%、38.8%和 11.0%。與第 1個(gè) QTL位點(diǎn)距離較近的標(biāo)記是 C9C10-4、B11C16-2，與第2個(gè)QTL位點(diǎn)距離較近的標(biāo)記是B13C10、HpmsE072，與第3個(gè)QTL位點(diǎn)距離較近的標(biāo)記是HpmsE124、hpms2-2，在這6個(gè)標(biāo)記中，HpmsE072、HpmsE124和hpms2-2屬于SSR標(biāo)記。通過對(duì)本試驗(yàn)中構(gòu)建的辣椒遺傳圖譜的第 7連鎖群、Lee等（2004）構(gòu)建的辣椒遺傳圖譜的第11連鎖群、已公布（http：//solgenomics.net/）的辣椒第10和第11條染色體DNA序列、Ben Chaim等（2001）構(gòu)建的辣椒抗CMV遺傳圖譜的第11連鎖群上的標(biāo)記進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，可以通過其上的標(biāo)記將本試驗(yàn)定位的第3個(gè)QTL位點(diǎn)與Ben Chaim等（2001）定位的主效QTL位點(diǎn)cmv11.1聯(lián)系起來。說明本試驗(yàn)定位的QTL位點(diǎn)有可能與Ben Chaim等（2001）定位的QTL位點(diǎn)是同一位點(diǎn)，也可能是同一連鎖群上的不同抗CMV位點(diǎn)。這需要進(jìn)一步加密遺傳圖譜，尋找更多的抗CMV位點(diǎn)。

本試驗(yàn)中得到3個(gè)QTL位點(diǎn)的LOD值分別為3.78、3.35、3.73，QTL數(shù)量較少，可能與標(biāo)記數(shù)量偏少和圖譜密度不夠有關(guān)，有待于進(jìn)一步增加新的標(biāo)記，豐富遺傳圖譜。

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