林云成，武 瑞，王躍強，吳國軍，郭婷婷，韓 旭

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

近年來，畜禽免疫抑制性疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害，因此，人們越來越重視通過應用免疫增強劑來提高畜禽機體抗病力。免疫增強劑主要分為化學合成小分子、微生物制劑、生物制劑和中草藥等［1］。其中，中草藥因具有資源豐富、價格低廉、毒副作用小、作用廣泛等優(yōu)點而備受青睞［2］。中藥免疫增強劑的研究與開發(fā)具有廣闊的應用前景，但其作用機制尚不清楚。本試驗旨在通過檢測昆明系小鼠免疫指標，探討歸芪甘草湯的作用途徑和機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 6周齡昆明系小鼠120只，體重18～22g，雌雄各半，成年豚鼠3只，均購自長春生物制品研究所。公雞1只，市售。

1.2 試驗材料 歸芪甘草湯（由黃芪、當歸、炙甘草、熟地和黨參組成，通過傳統(tǒng)水煎法獲得復方藥液，濃縮為含生藥量1g／mL）；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（Cy，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：10011121）為3mg／mL的注射液；CD4／CD8熒光抗體（購于Miltenyi Biotec公司）；Alsever＇s溶液；雞紅細胞懸液和補體制備［3］。

1.3 試驗主要儀器 XSP-18S光學顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；Z36HK高速冷凍離心機（德國Hermle公司）；Aira分選式流式細胞儀（美國BD公司）；V-5100可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.4 試驗設計與內容 選擇6周齡昆明系小鼠120只，預飼2d后，隨機分為4組（即對照Ⅰ組、試驗Ⅰ組、對照Ⅱ組和試驗Ⅱ組），每組30只小鼠，雌雄各半。分別進行健康動物復方中藥應用試驗（試驗Ⅰ組小鼠每日每只灌服0.5mL復方中藥，對照Ⅰ組小鼠每日每只灌服等量蒸餾水）和免疫抑制動物復方中藥應用試驗（對照Ⅱ組和試驗Ⅱ組小鼠，在試驗第3、5、7、9天均腹腔注射濃度為3mg／mL的免疫抑制劑0.5mL，復制小鼠免疫抑制模型；在復制模型的同時，試驗Ⅱ組小鼠每日每只灌服0.5mL復方中藥，對照Ⅱ組小鼠灌服等量蒸餾水）。

1.4.1 小鼠T淋巴細胞亞群CD4+和CD8+的檢測 在試驗第15天，每組取10只小鼠放血處死取脾臟。用紅細胞裂解液（ACK）反復裂解脾臟內紅細胞，當脾臟T淋巴細胞容積恒定后，用PBS洗除ACK，并將T淋巴細胞稀釋為2×106cells／mL細胞懸液。取500μL細胞懸液，同時加入CD4+、CD8+熒光抗體各8μL，4℃避光孵育30min后，上流式細胞儀進行檢測。

1.4.2 小鼠B淋巴細胞IgM的檢測 在試驗第8天，每組取10只小鼠腹腔注射5%生理鹽水雞血紅細胞懸液0.2mL進行免疫，做好標記，專用于IgM的檢測。在試驗第15天，小鼠眼球框靜脈插管取血，應用比色法測定光密度［3］。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的檢測 在試驗第15天灌服復方中藥4h后，每組取10只小鼠腹腔注射3%雞血紅細胞懸液0.5mL，2h后脫頸處死小鼠，腹腔注入生理鹽水2mL，輕揉小鼠腹部，吸取腹腔沖洗液，滴片，自然晾干后用瑞氏染色，顯微鏡觀察，計算巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)［3］。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用平均值±標準差表示試驗結果，采用LSD進行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 歸芪甘草湯對小鼠CD4+和CD8+的影響 見表1。

表1 歸芪甘草湯對小鼠T淋巴細胞表面分子CD4＋%、CD8＋%及CD4＋／CD8＋的影響（n=10）

表1 歸芪甘草湯對小鼠T淋巴細胞表面分子CD4＋%、CD8＋%及CD4＋／CD8＋的影響（n=10）

注：不同的小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；不同的大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。下表同

2.2 歸芪甘草湯對小鼠B淋巴細胞IgM的影響 見表2。

表2 歸芪甘草湯對小鼠B淋巴細胞IgM的影響（n=10，）

表2 歸芪甘草湯對小鼠B淋巴細胞IgM的影響（n=10，）

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2.3 歸芪甘草湯對小鼠巨噬細胞功能的影響 見表3。

表3 歸芪甘草湯對試驗小鼠巨噬細胞功能的影響（n=10，）

表3 歸芪甘草湯對試驗小鼠巨噬細胞功能的影響（n=10，）

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3 分析與討論

T淋巴細胞在機體特異性細胞免疫中發(fā)揮重要的作用。CD4和CD8是T淋巴細胞表面重要亞群，它們會在成熟T淋巴細胞表面表達CD4+（TH細胞）和CD8+（TC細胞）；TH細胞分泌的細胞因子可以促進T、B細胞免疫應答，TC細胞分泌的細胞因子具有免疫抑制和細胞毒性作用［4］；當機體細胞免疫功能正常時，CD4+／CD8+處于恒定范圍；因此，可以通過檢測T淋巴細胞表面亞群CD4+／CD8+來了解機體細胞免疫功能。試驗結果表明，對健康小鼠，灌服復方中藥和灌服蒸餾水的小鼠CD4+／CD8+差異不顯著（P＞0.05），這說明健康小鼠CD4+／CD8+處于動態(tài)平衡；對免疫抑制小鼠，灌服復方中藥和灌服蒸餾水的小鼠CD4+／CD8+差異極顯著（P＜0.01），這說明復方中藥可以有效增強免疫功能受損小鼠的細胞免疫功能。

溶血素（IgM）是B淋巴細胞產生最早的免疫球蛋白分子，也是在B淋巴細胞表面表達最早的抗體，在人工免疫或病原體感染后，它將最早產生，因此血清中IgM含量檢測可作為評價體液免疫功能之一［5］。試驗結果表明，無論是健康小鼠還是免疫抑制小鼠，灌服復方中藥后，其OD值均高于灌服蒸餾水小鼠，這說明復方中藥具有提高小鼠IgM含量，增強小鼠體液免疫功能的作用。

巨噬細胞是機體非特異性免疫的重要組成部分，具有吞噬、殺傷、抗原遞呈、分泌生物活性物質、調控局部組織微環(huán)境以及抑制腫瘤等多種免疫功能。試驗結果表明，灌服中藥的健康小鼠和免疫抑制小鼠巨噬細胞功能均比灌服蒸餾水小鼠強，這說明復方中藥可以增強小鼠腹腔巨噬細胞功能。

4 結語

綜上所述，本復方中藥提取液可以增強昆明系小鼠的免疫功能，尤其是對免疫抑制小鼠的免疫功能增強更為明顯。因此，研究開發(fā)動物專用的中藥免疫增強劑具有實際意義和廣闊的應用前景。

［1］段若竹，吳劍波.免疫增強劑的研究應用及展望［J］.國外醫(yī)藥：抗生素分冊，2006，27（2）：54-57.

［2］曹禮華，劉家國.中藥對機體免疫功能影響研究進展［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008，（3）：28-30.

［3］謝仲權，牛樹琦，劉鳳華.天然中草藥飼料添加劑研究方法［M］.北京：中國農業(yè)科技出版社，2001：87-88.

［4］韓愛云.熱應激對肉雞淋巴細胞鈣信號轉導的影響及鉻的調控作用［M］.北京：中國農業(yè)科學院，2010：18.

［5］崔治中，崔保安.獸醫(yī)免疫學［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2004：44.