張 靜，吳開(kāi)菊，馬保瑞，吳俊偉

（西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

1 材料與方法

1.1 藥品 恩諾沙星，含量為99.8%，批號(hào)：1002272；磺胺二甲氧嘧啶鈉，含量為98.4%，批號(hào)：20100304；土霉素，含量為87.4%，批號(hào)：20100410；慶大霉素，含量為624.6IU／mg，批號(hào)：10012031；硫酸粘菌素，含量為98%，批號(hào)：0809051；苯扎溴銨，含量為0.85%～0.95%，批號(hào)：091101。均由重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供。

1.2 菌株 大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 培養(yǎng)基及試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：100121；麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：100310；氫氧化鈉，成都東金化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100305。

1.4 體外抑菌試驗(yàn) 根據(jù)5種抗菌藥物的理化性質(zhì)，用適宜的溶劑溶解后，配成5120μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌后，分裝于滅菌的離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆?。苯扎溴銨用無(wú)菌水配成0.1%儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

操作方法：以恩諾沙星為例，采用試管二倍稀釋法進(jìn)行，將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液用肉湯做10倍稀釋?zhuān)髦Z沙星溶液做10倍稀釋。取滅菌試管排列在試管架上，經(jīng)紫外線照射后，在每只試管內(nèi)加入2mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，在第一支試管內(nèi)加入2mL恩諾沙星溶液，用移液器吹吸混勻后，吸出2mL至第2支試管，依次做倍比稀釋?zhuān)恋?管混勻后棄去2mL，此時(shí)，恩諾沙星的濃度依次為256、128、64、32、16、8、4μg／mL。

每組設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（菌液對(duì)照）、陰性對(duì)照（藥液對(duì)照）、空白對(duì)照（肉湯對(duì)照）3個(gè)對(duì)照，用微量移液器取100μL稀釋后的菌液，依次加入倍比稀釋的含藥試管以及菌液對(duì)照管中，使最終接種菌量為5×105CFU／mL。每種藥物做雙樣品測(cè)定，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度。若第一次試驗(yàn)未能測(cè)出相應(yīng)的MIC，則適當(dāng)擴(kuò)大藥物稀釋濃度。

1.5 亞抑菌濃度苯扎溴銨誘導(dǎo)大腸桿菌質(zhì)控菌耐藥 根據(jù)苯扎溴銨的 MIC，配制1／2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC、128×MIC含藥麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基，在含1／2×MIC藥物濃度的麥康凱培養(yǎng)基接種適量培養(yǎng)物（約105CFU），37℃培養(yǎng)24h，挑選生長(zhǎng)良好的菌落，接種于1×MIC誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，以此類(lèi)推，逐漸提高培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的濃度直到誘導(dǎo)前MIC的128倍［1］。誘導(dǎo)耐藥的大腸桿菌質(zhì)控菌為ATCC25922YD。

1.6 受試藥品對(duì)誘導(dǎo)耐藥后的大腸桿菌質(zhì)控菌的最小抑菌濃度測(cè)定 同樣采用試管二倍稀釋法，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn) 0.1%苯扎溴銨作體外抑菌試驗(yàn)，測(cè)得MIC為0.125μg／mL，而恩諾沙星、慶大霉素、硫酸粘菌素、磺胺二甲氧嘧啶鈉和土霉素的MIC分別為2μg／mL、1μg／mL 、32μg／mL、0.25 μg／mL和1μg／mL。

2.2 亞抑菌濃度苯扎溴銨誘導(dǎo)大腸桿菌質(zhì)控菌耐藥 采用平板劃線培養(yǎng)，以1／2×MIC苯扎溴銨濃度為起始點(diǎn)開(kāi)始誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)到128×MIC。獲得了對(duì)苯扎溴銨高度耐藥的大腸桿菌誘導(dǎo)菌株ATCC25922YD。

2.3 誘導(dǎo)后的大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 誘導(dǎo)前后5種抗菌藥物對(duì)大腸桿菌質(zhì)控菌ATCC25922的 MIC （μg／mL）

由表1可以看出，經(jīng)亞抑菌濃度苯扎溴銨誘導(dǎo)耐藥的大腸桿菌ATCC25922磺胺二甲氧嘧啶鈉、土霉素產(chǎn)生高水平耐藥，其中土霉素的MIC擴(kuò)大了500倍；而對(duì)恩諾沙星及慶大霉素的MIC變化維持在2～4倍；對(duì)硫酸粘菌素的MIC沒(méi)有影響。

3 討論

3.1 亞抑菌濃度的消毒劑能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥亞抑菌濃度的抗菌藥物可以誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥［2］，在低濃度消毒劑持續(xù)作用下，細(xì)菌的自身耐受性會(huì)發(fā)生變化，從而產(chǎn)生生理適應(yīng)性耐藥。班海群［3］報(bào)道，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)期處于低濃度消毒劑作用下，會(huì)增加細(xì)菌的基因突變率，引起消毒劑靶位改變、外排泵系統(tǒng)上調(diào)或下調(diào)、膜孔蛋白丟失等。以上因素均會(huì)使細(xì)菌對(duì)亞抑菌濃度下的消毒劑產(chǎn)生耐藥性。

3.2 消毒劑誘導(dǎo)菌株對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥 早在1993年Levy等［4］報(bào)道，在含2～5mg／L四環(huán)素或5～10mg／L氯霉素平板上連續(xù)劃線培養(yǎng)，可以得到同時(shí)對(duì)四環(huán)素、氯霉素、青霉素、利福平等多種抗生素的多重耐藥菌株，但由消毒劑誘導(dǎo)的對(duì)抗菌藥物的多重耐藥菌未見(jiàn)報(bào)道。細(xì)菌對(duì)抗菌藥物和消毒劑的耐藥機(jī)制有相似之處，許多介導(dǎo)細(xì)菌消毒劑耐藥的機(jī)制同樣可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，如主動(dòng)外排泵表達(dá)亢進(jìn)、膜通透性改變、滲透性改變等。由表1可以看到，對(duì)苯扎溴銨高度耐藥的大腸桿菌ATCC25922YD，對(duì)抗菌藥物同樣產(chǎn)生了不同水平的耐藥。

3.3 外排泵介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥機(jī)制 細(xì)菌的外排系統(tǒng)是一種非特異性耐藥機(jī)制，它是由藥物主動(dòng)外排泵來(lái)完成的。藥物外排泵是一類(lèi)位于細(xì)胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度聚集達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，藥物外排泵相關(guān)mRNA的表達(dá)量增加，使細(xì)胞膜上外排泵的數(shù)量增加，使藥物泵出菌體，從而加強(qiáng)細(xì)菌在藥物選擇壓力下的生存能力，產(chǎn)生耐藥。細(xì)菌主動(dòng)外排泵系統(tǒng)一般由3部分組成：外膜通道蛋白、融合蛋白和胞質(zhì)膜外排蛋白。大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外排泵最多的一種細(xì)菌，一般認(rèn)為AcrAB-Tolc是最主要的外排泵，且此外排泵底物廣泛，可以外排吖啶橙、結(jié)晶紫、溴乙啶、鐮孢菌酸、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、紅霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氯比西林、氟喹諾酮類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、利福平、吐溫X-100等多種制劑［5］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物及磺胺類(lèi)藥物均產(chǎn)生了耐藥，這可能是可以外排消毒劑的大腸桿菌外排泵AcrAB-Tolc高水平表達(dá)，而此外排泵底物廣泛，同時(shí)又可以外排一些抗菌藥物所致。而四環(huán)素類(lèi)抗菌藥土霉素產(chǎn)生了高水平耐藥，但對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物恩諾沙星的最小抑菌濃度變化只有2倍，這可能與四環(huán)素類(lèi)藥物存在另外的外排系統(tǒng)Tet有關(guān)［5］。經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌對(duì)硫酸粘菌素并未產(chǎn)生耐藥，硫酸粘菌素的作用機(jī)制［6］不同于其他抗菌藥物，硫酸粘菌素首先吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜，結(jié)合細(xì)胞膜中脂蛋白的游離磷酸鹽，引起細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破損，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。所以經(jīng)亞抑菌濃度的消毒劑誘導(dǎo)而得的大腸桿菌ATCC25922YD并未對(duì)其產(chǎn)生耐藥。

3.4 消毒劑與抗菌藥物濫用與細(xì)菌耐藥的相關(guān)性消毒劑廣泛應(yīng)用在醫(yī)院、養(yǎng)殖場(chǎng)以及食品加工廠等場(chǎng)所，日趨多樣的應(yīng)用空間以及缺乏科學(xué)的使用常識(shí)，會(huì)使細(xì)菌通過(guò)誘導(dǎo)耐藥的方式對(duì)消毒劑產(chǎn)生耐藥性，繼而引發(fā)對(duì)抗菌藥物的耐藥。反之，由于消毒劑與抗菌藥物存在某些共同作用靶點(diǎn)與耐藥機(jī)制，長(zhǎng)期濫用抗生素很可能也會(huì)造成對(duì)消毒劑的耐藥性。提示在細(xì)菌耐藥性嚴(yán)重的今天，醫(yī)院和養(yǎng)殖場(chǎng)等場(chǎng)所長(zhǎng)期不科學(xué)使用消毒劑將對(duì)解決細(xì)菌耐藥帶來(lái)新的困難，應(yīng)引起高度重視。

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