彭志平，蔣明東，尹曉玲，文明，李少林（重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，重慶市400016）

化學藥物治療是臨床上肝癌治療的重要手段之一，但存在于腫瘤細胞的多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）機制卻嚴重阻礙了化療藥物的療效[1]。研究[2]表明，多藥耐藥基因mdr1及其編碼蛋白過度表達是肝癌細胞產生MDR的一條重要途徑。因此，從基因水平研究抑制mdr1基因的表達來逆轉肝癌細胞MDR，以期增加腫瘤化療的敏感性是非常必要的。在本研究中，筆者以mdr1基因為靶點，設計并合成寡脫氧核苷酸（ODN），其中ODN分為反義ODN（ASODN）和正義ODN（SODN），從體外培養(yǎng)耐阿霉素（ADM）肝癌細胞HepG2/ADM來觀察ASODN對其mdr1基因表達及化療藥物抑制肝癌細胞增殖的影響，探討ASODN逆轉肝癌細胞MDR的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Forma細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；480型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國PE公司）；Fotodyne 60-2107型凝膠成像系統(tǒng)（美國Image公司）；550型全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）；752型紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠）。

1.2 試藥

逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒及DNA分子量標記X174HincⅡ digest Maker（日本Takara公司）；總RNA抽提試劑盒和轉染試劑盒（轉染試劑為脂質體）（美國Invitrogen公司）；蛋白質分子量標準（大連寶生物工程有限公司，范圍：6.5～200 kDa）mdr1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；mdr1-ASODN、mdr1-SODN及引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）；MTT（美國Sigma公司）；ADM注射用粉末（美國法瑪西亞制藥公司，批號：20081103，規(guī)格：每瓶10 mg）；順鉑注射用粉末（DDP，美國施貴寶公司，批號：20081104，規(guī)格：每支20 mg）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，江蘇同泰藥業(yè)有限公司，批號：20081105，規(guī)格：250 mg∶10 mL）。

ODN及引物序列見表1。

表1 ODN及引物序列Tab 1 Sequence of oligodeoxyribonucleotide and primer

1.3 細胞

人肝癌細胞HepG2由重慶醫(yī)科大學病理生理學教研室段紅教授惠贈；耐ADM肝癌細胞HepG2/ADM由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院核醫(yī)學實驗室建立，方法如下：將ADM加入至HepG2細胞培養(yǎng)液中，按培養(yǎng)瓶內ADM終濃度逐次遞加0.1 mg·L－1，當細胞存活率達到90%以上時，再進行下一梯度的耐藥誘導，直至終濃度達到2 mg·L－1。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100 u·mL－1、鏈霉素100 u·mL－1），37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)HepG2/ADM細胞。取對數(shù)生長期HepG2/ADM細胞，以DMEM培養(yǎng)液稀釋制成2×105個/mL細胞懸液備用。

2.2 反義抑制試驗

2.2.1 分組。試驗分為mdr1-ASODN處理組、mdr1-SODN對照組和空白對照組。mdr1-ASODN處理組：HepG2/ADM細胞中加入mdr1-ASODN和脂質體混合液；mdr1-SODN對照組：HepG2/ADM細胞中加入mdr1-SODN和脂質體混合液；空白對照組：HepG2/ADM細胞中加入脂質體。

2.2.2 脂質體轉染。于6孔細胞培養(yǎng)板中接種HepG2/ADM細胞（濃度為2×105個/mL），加入無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)液，大約24 h后，按照“2.2.1”項下分組加入ODN與脂質體混合液（ODN與脂質體質量比為1∶3）200μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。去除轉染液，每孔加DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。脂質體轉染參照轉染試劑盒說明書進行。

2.2.3 mdr1mRNA表達的檢測。采用RT-PCR法，提取各組細胞的總RNA，并用分光光度計定量，取3μg RNA在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。取5μg RNA為模板，用mdr1的特異引物，逆轉錄合成cDNA。PCR操作按試劑盒說明書進行，同時以β-actin為內參對照；并以水作為陰性對照檢測試驗過程是否有污染。取PCR擴增產物10μL在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，對PCR產物瓊脂糖凝膠電泳進行圖像照相及掃描分析，得β-actin及mdr1mRNA表達的灰度值，以mdr1mRNA灰度值/β-actin灰度值，表示mdr1mRNA表達相對含量，比較3組間mdr1mRNA表達的差異。

2.2.4 mdr1蛋白表達的檢測。采用蛋白免疫印跡法，分別提取各培養(yǎng)孔HepG2/ADM細胞的胞漿蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白樣品轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白封閉液37℃封閉PVDF膜1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌，加mdr1單克隆抗體（1∶300）37 ℃孵育4 h，PBST振蕩洗滌2次，加過氧化物酶標記二抗（1∶200）37℃孵育20 min，PBST洗滌4次，每次5 min，DAB室溫顯色，對顯色結果進行照相及圖像掃描分析，得β-actin及mdr1蛋白表達的灰度值，以mdr1蛋白灰度值/β-actin灰度值，表示mdr1蛋白表達相對含量，比較3組間mdr1蛋白表達的差異。

2.3 MTT法檢測HepG2/ADM細胞對化療藥物的敏感性

HepG2/ADM細胞轉染mdr1-ASODN繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期細胞作試驗組，未經轉染處理的細胞作對照組，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔細胞數(shù)2×104個，每孔總體積200 μL。每個樣本設3個平行孔。2組細胞中分別加入培養(yǎng)液終濃度分別含20、10、50 mg·L－1的ADM、DDP和5-FU，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入0.5 mg·mL－1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，振蕩5 min，酶標儀（570 nm）檢測吸光度（A），計算平行孔平均A值，計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率＝（1－試驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 HepG2/ADM細胞中mdr1mRNA表達比較

結果表明，本試驗過程沒有污染，空白對照組、mdr1-SODN對照組、mdr1-ASODN處理組mdr1mRNA表達相對含量分別為0.97±0.11、0.82±0.08、0.26±0.09。與mdr1-SODN對照組和空白對照組比較，mdr1-ASODN處理組HepG2/ADM細胞中mdr1mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。各組HepG2/ADM細胞中mdr1mRNA表達比較見圖1。

3.2 HepG2/ADM細胞中mdr1蛋白表達比較

圖1 各組HepG2/ADM細胞中mdr1mRNA表達比較Fig 1 Comparison of mdr1mRNA expression of HepG2/ADM in each group

結果表明，空白對照組、mdr1-SODN對照組、mdr1-ASODN處理組mdr1蛋白表達相對含量分別為0.66±0.07、0.62±0.08、0.34±0.07。與mdr1-SODN對照組和空白對照組比較，mdr1-ASODN處理組HepG2/ADM細胞中mdr1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。各組HepG2/ADM細胞中mdr1蛋白表達比較見圖2。

圖2 各組HepG2/ADM細胞中mdr1蛋白表達比較Fig 2 Comparison of mdr1protein expression of HepG2/ADM in each group

3.3 HepG2/ADM細胞對化療藥物的敏感性

與對照組比較，ADM、DDP和5-FU對試驗組HepG2/ADM細胞增殖抑制率均明顯增加（P＜0.05），說明mdr1-ASODN轉染部分恢復了HepG2/ADM細胞對化療藥物的敏感性。2組HepG2/ADM細胞的增殖抑制率比較詳見表2。

表2 2組HepG2/ADM細胞的增殖抑制率比較（%%，±s，n＝3）Tab 2 Comparison of proliferation inhibition ratio of HepG2/ADM（%%，±s，n＝3）

表2 2組HepG2/ADM細胞的增殖抑制率比較（%%，±s，n＝3）Tab 2 Comparison of proliferation inhibition ratio of HepG2/ADM（%%，±s，n＝3）

組別對照組試驗組ADM 29.2±1.9 57.3±2.7 DDP 33.9±1.7 47.7±2.9 5-FU 31.6±1.6 52.2±2.3

4 討論

MDR是指一些腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產生耐藥性的同時對其他非同類藥物也產生耐藥性，這是造成腫瘤化學藥物治療失敗的主要原因。研究[3～6]發(fā)現(xiàn)，腫瘤MDR的產生與耐藥基因mdr1、mrp、lrp等表達上調有關，其中mdr1及其相應編碼產物過度表達又是產生MDR的主要因素，故從基因水平抑制mdr1基因的表達來逆轉腫瘤MDR的研究顯得十分必要。

反義技術[7，8]是應用堿基配對的原理，以表達某種特定蛋白的基因為靶基因，人工設計一段與之互補的基因片段封閉該靶基因的表達，使之低表達或不表達，從而阻斷與此基因有關的一系列生物學行為。

本研究選擇肝癌細胞mdr1基因的關鍵區(qū)域作為靶基因，人為合成與之互補的脫氧核酸片段，在轉染ASODN后，檢測發(fā)現(xiàn)HepG2/ADM細胞中mdr1mRNA及其蛋白表達明顯降低（P＜0.05），說明ASODN能夠進入體外培養(yǎng)細胞內與靶基因特異性結合，產生抑制靶基因表達的效果。

HepG2細胞屬人肝癌組織細胞，能大容量培養(yǎng)和傳代，是肝癌耐藥試驗研究的常用細胞株。腫瘤細胞對化療藥物的敏感性檢測常常采用MTT法[9，10]。MTT是一種簡便快捷的體外藥敏檢測法，人為誤差小。在MTT試驗中，筆者將經過mdr1-ASODN轉染前、后的HepG2/ADM細胞分別用肝癌常用化療藥物ADM、DDP和5-FU處理，結果發(fā)現(xiàn)轉染后的細胞增殖抑制率較轉染前均有明顯提高，說明MDR肝癌細胞部分恢復了對化療藥物的敏感性。

本試驗表明，體外ASODN能有效抑制mdr1基因的表達，并恢復肝癌HepG2/ADM細胞對化療藥物的敏感性，是一種逆轉腫瘤MDR的有效手段。但是ASODN應用于體內逆轉MDR，其自身的體內穩(wěn)定性及對腫瘤細胞的靶向性作用將是今后研究的重點方向和難點問題。

[1] Giglia JL，Antonia SJ，Berk LB，et al.Systemic therapy for advanced hepatocellular carcinoma：past，present，and future[J].Cancer Control，2010，17（2）：120.

[2] 許景峰.腫瘤細胞mdr1基因多藥耐藥的研究進展[J].解放軍藥學學報，2010，26（5）：453.

[3] Vi?olas N，Provencio M，Reguart N，et al.Single nucleotide polymorphisms in MDR 1 gene correlates with outcome in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with cisplatin plus vinorelbine[J].Lung Cancer，2011，71（2）：191.

[4] 翟寶進，伍 烽，邵澤勇，等.阿霉素誘導人肝癌細胞多藥耐藥株的建立及其生物學特性評價[J].癌癥，2004，23（4）：391.

[5] Salih SM.Retrovirus-mediated multidrug resistance gene（MDR1）overexpression inhibits chemotherapy-induced toxicity of granulosa cells[J].Fertility and Sterility，2011，95（4）：1 390.

[6] 朱寶英，黃 靜，王永林，等.P-糖蛋白及腫瘤多藥耐藥的逆轉[J].中國藥房，2011，22（6）：550.

[7] Leonetti C，Zupi G.Targeting different signaling pathways with antisense oligonucleotides combination for cancer therapy[J].Curr Pharm Des，2007，13（5）：463.

[8] 梁秦龍，王 梅，王 冰，等.反義寡核苷酸抑制人惡性黑素瘤A375細胞survivin mRNA及其蛋白的表達[J].西安交通大學學報，2008，29（5）：570.

[9] Hoffmann K，franz C，Zhi X，et al.Sorafenib modulates the gene expression of multi-drug resistance mediating ATP-binding cassette proteins in experimental hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Research，2010，30（11）：4 503.

[10] 師以康，吳淑英，黃云虹，等.基因mdr1高表達多藥耐藥腫瘤細胞對力達霉素的藥物敏感性[J].藥學學報，2006，41（12）：1 146.