張軼，楊麗娟，王倩倩，張金蓮，孫祥德#（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，新鄉(xiāng)市453003；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新鄉(xiāng)市 453003）

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl-2-furaldehyde，5-HMF）是葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的一種醛類化合物，廣泛存在于含有糖類物質(zhì)的中藥材和食品中。研究[1]表明，5-HMF一方面具有神經(jīng)毒性，對人體橫紋肌及器官組織有損害，但另一方面具有抗氧化、抗心肌缺血等對人體有益的作用[2]。因此，深入開展包括5-HMF與生物大分子相互作用等方面的研究，可為闡明相關(guān)中藥及復(fù)方制劑的藥理、毒理作用提供試驗依據(jù)。

生命體內(nèi)普遍存在著競爭性反應(yīng)，其中活性小分子與生物大分子的相互作用就是這種競爭反應(yīng)的表現(xiàn)。這種相互作用使得血清白蛋白能與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)結(jié)合，從而起著載體蛋白的運輸作用[3]。在生命科學(xué)的研究中，了解蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)的結(jié)合特性等信息，可以有助于對疾病的診斷和治療提供有價值的信息。因此，關(guān)于小分子與大分子相互作用的研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。其中藥物和蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制研究近年來引起了廣泛關(guān)注[4～7]。

目前，人們對5-HMF研究多集中在其藥理毒理方面[8]，與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用尚未見報道。鑒于此，筆者運用熒光光譜法和紫外光譜法對5-HMF與BSA的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了探討，計算了結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點數(shù)n，并基于F?rster的能量轉(zhuǎn)移理論，計算了供體與受體間的距離，從而得到了5-HMF與BSA相互作用的若干信息，以期對全面了解5-HMF的體內(nèi)過程提供更多的理論參考。

5-HMF化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖15 -HMF的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FP-6500型熒光光譜儀、UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥

BSA（美國Sigma公司，批號：D0009，純度：98.0%，使用時用緩沖溶液溶解制備成相應(yīng)濃度）；5-HMF（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0298，純度：99.0%，使用時用緩沖溶液溶解制備成相應(yīng)濃度）；磷酸鹽緩沖溶液（臨用前制備，內(nèi)含0.5 mol·L－1NaCl，pH＝7.4）；試驗用水為二次蒸餾水；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 試驗設(shè)計

本試驗以熒光光譜和紫外光譜研究5-HMF與BSA相互作用的光譜特性，先測定二者作用后體系的熒光強(qiáng)度，根據(jù)Stern-Volmer方程和結(jié)合常數(shù)表達(dá)式求出猝滅速率常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)；通過熱力學(xué)參數(shù)分析二者的相互作用機(jī)制；當(dāng)5-HMF和BSA的摩爾濃度為1∶1時，5-HMF的紫外吸收光譜和BSA的熒光光譜有重疊現(xiàn)象，按照F?rster能量轉(zhuǎn)移理論，計算重疊積分，求出5-HMF與BSA之間的結(jié)合距離r；測定5-HMF、BSA及二者作用后體系的紫外光譜，根據(jù)光譜的變化進(jìn)一步證明二者之間的相互作用。

2.2 熒光光譜分析

移取2.0 mL BSA工作液（濃度為1×10－6mol·L－1）于1 cm石英池中，加入適量5-HMF溶液（濃度為1×10－4mol·L－1），制得5-HMF的最終濃度分別為0、0.25×10－6、0.5×10－6、1.0×10－6、1.5×10－6、2.0×10－6、2.5×10－6、3.0×10－6、3.5×10－6、4.0×10－6、4.5×10－6、5.5×10－6mol·L－1的各混合溶液（記為溶液1→12）。設(shè)定激發(fā)波長為278 nm，在300～450 nm波長范圍內(nèi)分別掃描27℃和37℃時溶液的熒光光譜，并記錄346 nm波長處的熒光強(qiáng)度，繪制BSA的熒光猝滅圖。

取5-HMF和BSA的摩爾濃度為1∶1混合溶液（濃度均為1.0×10－6mol·L－1），分別進(jìn)行紫外掃描和熒光掃描，對二者光譜重疊部分計算重疊積分。

2.3 紫外吸收光譜分析

移取2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液于1 cm比色皿中，加入20 μL 5-HMF溶液，其終濃度為1.0×10－6mol·L－1，體系混合均勻后，用上述磷酸鹽緩沖溶液作參比，分別掃描27℃時5-HMF在250～350 nm和300～450 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，記錄吸光度。

移取2.0 mL BSA工作液（濃度為1.0×10－6mol·L－1）于1 cm比色皿中，加入 5-HMF溶液（濃度為1.0×10－4mol·L－1）適量，得5-HMF的最終濃度分別為0、2.0×10－6、4.0×10－6mol·L－1的混合溶液。用磷酸鹽緩沖溶液作參比，掃描27℃時溶液在250～350 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，記錄吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 5-HMF與BSA結(jié)合反應(yīng)的熒光猝滅機(jī)制

BSA的熒光猝滅光譜圖（27℃）見圖2；混合溶液的紫外、熒光掃描光譜圖見圖3。

圖2 5-HMF對BSA的熒光猝滅光譜（27℃）Fig 2 Fluorescence quenching spectrum of BSA as 5-HMF is added at 27℃

圖3 5-HMF的吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜的重疊圖Fig 3 Spectral overlap of 5-HMF absorption spectrum with BSAfluorescence spectrum

從圖2中可看出，隨著5-HMF濃度的升高，BSA的熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明BSA熒光發(fā)射峰出現(xiàn)了明顯的猝滅現(xiàn)象，可見，5-HMF對BSA有猝滅作用。

熒光猝滅機(jī)制主要有動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移等。動態(tài)猝滅是由蛋白質(zhì)激發(fā)態(tài)分子與藥物由于熱運動而發(fā)生碰撞引起的，其過程符合Stern-Volmer方程[9]：

式中，F(xiàn)0和F分別為BSA與5-HMF作用前、后的熒光發(fā)射強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)（L·mol－1·s－1）；τ0為未加猝滅劑時熒光體的壽命，對于生物大分子，其值約為10－8s[10]；c為5-HMF濃度（mol·L－1）；KSV為Stern-Volmer常數(shù)（L·mol－1），可通過猝滅曲線斜率得到。分別測定27℃和37℃時5-HMF與BSA作用的熒光光譜。假設(shè)5-HMF對BSA的熒光猝滅屬于動態(tài)猝滅，以F0/F對c作Stern-Volmer曲線。根據(jù)KSV＝Kqτ0處理試驗數(shù)據(jù)，可分別求得不同溫度下的猝滅速率常數(shù)Kq，結(jié)果見表1。

由表1可見，5-HMF對BSA猝滅過程速率常數(shù)（Kq）遠(yuǎn)大于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol－1·s－1[11]。因此動態(tài)猝滅不是BSA熒光猝滅的主要原因。而且隨溫度升高，BSA的KSV降低，說明5-HMF對BSA猝滅過程為靜態(tài)猝滅。

表1 結(jié)合反應(yīng)常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)測定結(jié)果Tab 1 Binding constants and thermodynamic parameters

3.2 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)的計算

靜態(tài)猝滅是由蛋白質(zhì)基態(tài)分子與藥物形成了不發(fā)射熒光的配合物引起。設(shè)藥物在蛋白質(zhì)分子上有n1個相同且獨立的結(jié)合位點，則熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度的關(guān)系可由熒光分子與猝滅劑分子之間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式求出[11]。

式中，n1和K分別表示結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)。計算結(jié)果見表1。

由表1可見n1約為1，說明1個BSA分子結(jié)合1個藥物分子。

3.3 5-HMF與BSA的能量轉(zhuǎn)移

按照F?rster能量轉(zhuǎn)移理論[12]：轉(zhuǎn)移效率E與給體-受體之間的結(jié)合距離r和臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有關(guān)。

式中，F(xiàn)′為能量給體和受體為1∶1時能量給體的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0′為未加入受體時給體的熒光強(qiáng)度，R0是能量轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離。

式中，F(xiàn)（λ）為熒光給體在波長λ處的熒光強(qiáng)度，ε（λ）則為受體在波長λ處的摩爾消光系數(shù)，Δλ為計算重疊積分時分割的波長跨度。將圖3中光譜重疊部分采用矩形分割法按式（5）得J＝1.11×10－13cm3·L·mol－1，根據(jù)式（4）得R0＝4.7 nm。由式（3）可得r＝5.6 nm。r＜7 nm說明二者之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移[13]。

式中，K2為偶極空間取向因子（K2＝2/3），ΦD為給體（BSA）的光量子產(chǎn)率（ΦD＝0.118）；n2為介質(zhì)折射指數(shù)（n2＝1.336），J為供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜間的重疊積分，可表示為：

3.4 5-HMF與BSA的主要作用力的類型

藥物與生物大分子之間的結(jié)合力主要包括氫鍵、靜電引力、疏水作用力和范德華力等，不同藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合力的類型是不同的。當(dāng)溫度變化不太大時，反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)焓ΔH可以看作常數(shù)，根據(jù)以下熱力學(xué)方程[11]：

式中，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度。通過結(jié)合常數(shù)，計算標(biāo)準(zhǔn)焓ΔH、自由能ΔG和標(biāo)準(zhǔn)熵ΔS，結(jié)果見表1。

結(jié)合表1數(shù)據(jù)再根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力之間的關(guān)系可知，由于ΔH＞0、ΔS＞0，因此5-HMF與BSA之間主要靠疏水作用力結(jié)合[14]。

3.5 紫外吸收光譜

5-HMF及與BSA混合后紫外吸收光譜見圖4。

圖4 紫外吸收光譜圖Fig 4 UV absorption spectrum

從圖4可見，BSA在278 nm波長處有吸收峰，當(dāng)加入5-HMF后，隨著藥物濃度從2.0×10－6mol·L－1增大到4.0×10－6mol·L－1，二者作用后吸光度升高，進(jìn)一步證明5-HMF與BSA之間存在著相互作用，形成了復(fù)合物[5]。

4 討論

本研究結(jié)果表明，5-HMF對BSA的內(nèi)源熒光具有較強(qiáng)猝滅作用，這種猝滅特征主要為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。從5-HMF與BSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點、結(jié)合距離和熱力學(xué)參數(shù)等數(shù)據(jù)可知，二者主要靠疏水作用力相結(jié)合，因此，5-HMF可以BSA為載體進(jìn)行貯存和運輸。

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