楊 珺 浙江省中醫(yī)院 杭州 310006

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）特別是 2型糖尿病患病率逐年升高[1]，已成為威脅人類健康的重大社會問題。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是DM常見并發(fā)癥之一。研究表明，環(huán)氧化酶-2（COX-2）在DN發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用[2]。地骨皮是茄科植物枸杞（Lycium chinese Mill）或?qū)幭蔫坭剑↙.barbarum L）的干燥根皮，味甘、性寒，具有清熱滋陰的功效。本研究通過觀察地骨皮對STZ大鼠腎臟COX-2表達的影響，探討其對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠125只，體重（300±20）g，購自中國科學院上海實驗動物中心，由浙江中醫(yī)藥大學SPF動物房飼養(yǎng)。生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2003-0003。

1.2 實驗藥品 地骨皮提取液（醇提，濃度為每毫升含生藥3g，由浙江中藥大學附屬第一醫(yī)院中藥制劑室提供）。馬來酸羅格列酮（葛蘭素史克公司，批號05120005）。鏈脲佐菌素（STZ）（CALBIOCHEM 生產(chǎn)，Cat#5762201，Lot#B56981）；環(huán)氧化酶-2 試劑盒（上海儀濤生物儀器有限公司產(chǎn)品，批號GT201202）。

1.3 實驗條件 SPF級屏障系統(tǒng)大鼠實驗飼養(yǎng)室，溫度（23±1）℃，濕度 50%～70%，光照 150～200Lx，12h明暗交替，噪音＜50dB。飲水：自來水過濾滅菌，置于高壓滅菌的飲水瓶中自由飲用。高脂高糖飼料：在基礎(chǔ)飼料中加入10%豬油、10%蛋黃、0.25%膽固醇、5%蔗糖，并用Co60輻照滅菌。普通飼料：Co60輻照滅菌大鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料。喂養(yǎng)方式：自由飲食，每籠飼養(yǎng)3只。造模后，每只大鼠稱重、標記編號，每日加飼料3次（9:00、15:00、21:00），每天加水 5次（6:30、9:30、14:30、18:30、21:30）。

1.4 造模與分組 125只SD大鼠，適應性飼養(yǎng)1周，稱體重，隨機抽取10只，為正常對照組，喂以標準飼料。另115只大鼠按30mg/kg的劑量一次性尾靜脈注射STZ，并飼以高脂飼料。3周后，尾靜脈取血測隨機血糖，間隔2天后禁食8h，球后取血分離血清，測血糖、胰島素。凡空腹血糖＞7.0mmol/L，體重明顯增加者成模。造模后篩選40只大鼠，隨機分為模型組、羅格列酮組、地骨皮醇提低劑量組、地骨皮醇提高劑量組，每組10只。

1.5 實驗方法 正常對照組、模型組大鼠以10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃；羅格列酮組大鼠以10mL/（kg·d）羅格列酮灌胃（羅格列酮溶于蒸餾水中，濃度為0.5mg/mL）；地骨皮醇提低、高劑量組大鼠分別以5mL/（kg·d）、10mL/（kg·d）地骨皮醇提取液灌胃。藥物治療周期為7周，1天1次，給藥途經(jīng)與臨床擬用途徑一致。

各組大鼠均于實驗給藥前禁食不禁水8h，于清晨空腹球后取血，置事先預備的Eppendorf管中，4℃存放4h，4000rpm低溫離心20min，取上清液，分裝置-20℃保存?zhèn)錅y生化指標、空腹胰島素。末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水8h，大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開腹腔，用5mL一次性注射器腹主靜脈取血5.5mL，置Eppendorf管中，4℃存放4h，4000rpm低溫離心20min，取上清液，分裝置-20℃保存?zhèn)錅y生化指標。并取腎臟組織以4%甲醛固定、石蠟包埋、切片。

1.6 環(huán)氧化酶-2測定 采用免疫組化法檢測，其中胞漿中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。每個標本隨機觀察10個視野，利用Dardrick等采用超微免疫標記半定量標準記錄：無膠體金顆粒為陰性（-），計0分；存在膠體金顆粒與背底染色相當可疑為（±），計1分；膠體金顆粒多于背底染色為陽性（+），計2分；密集膠體金顆粒為強陽性（++），計3分。

根據(jù)下列公式計算每個標本的平均膠體金強度：IS=∑{（0×F0）+（1×F1）+（2×F2）+（3×F3）}，F(xiàn)：%×10視野，即各計分所占每10個視野面積。所得結(jié)果即為各個標本的COX-2積分。

2 實驗結(jié)果

給藥后羅格列酮組和地骨皮醇提取液組腎臟環(huán)氧化酶-2表達與模型組比較有明顯改善，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），地骨皮醇提高劑量組與羅格列酮組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠腎臟COX-2表達量比較（±s）

表1 各組大鼠腎臟COX-2表達量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與羅格列酮組比較，▲P＜0.05。

組 別 n/只 COX-2正常對照組 10 0.27±0.08△模型組 10 1.75±0.11*羅格列酮組 10 0.93±0.14△*地骨皮醇提低劑量組 10 1.10±0.15△*▲地骨皮醇提高劑量組 10 0.89±0.12△*

3 討論

嚴格的血糖控制雖然能夠顯著降低DN發(fā)生率和延緩DN的病情進展，但仍有40%左右T2DM患者最終會出現(xiàn)DN，這也提示控制血糖并不是防治DN唯一有效的方法。我們用高脂飲食加小劑量STZ注射所制備的T2DM動物模型具有高血糖、高胰島素血癥伴肥胖、脂代謝異常等類似人類T2DM臨床特點。

COX是二十碳四烯酸合成前列腺素（PG）過程中的一個關(guān)鍵限速酶，目前已知它有兩種同工酶：COX-1和COX-2。COX-1廣泛分布于各種組織，一般情況下保持相對穩(wěn)定，以保證細胞的正?；顒?。COX-2則主要存在于炎癥細胞，促進炎癥反應和組織損傷。既往研究顯示，T2DM大鼠腎臟COX-2在6周及12周時均呈片狀表達，且表達量呈進行性升高，但無異位表達現(xiàn)象。大量的研究表明，糖尿病患者發(fā)病早期出現(xiàn)腎小球濾過率增高，而腎小球高濾過是導致DN發(fā)生功能與形態(tài)學改變的基礎(chǔ)[3]。前列腺素代謝異常是腎小球高濾過的因素之一，并與系膜增生以及基質(zhì)堆積有關(guān)[4]。近來研究表明[5-6]，DN大鼠腎組織COX-2表達增加，選擇性COX-2抑制劑可改善DN時腎臟損害的進展，使腎小球系膜基質(zhì)增生得到明顯改善，提示COX-2與腎小球的高灌注、高濾過明顯相關(guān)。因此，COX-2可能是糖尿病腎臟損害的重要因素之一，在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

地骨皮主要成分有多種脂肪酸、生物堿、二酰胺類、甾醇、肽類化合物等[7]，是臨床上治療糖尿病的常用藥物，有涼血止血，清熱退蒸，清泄肺熱，清熱滋陰，清熱解毒的功效。正符合2型糖尿病的治療大法“清熱潤燥，養(yǎng)陰生津”，而且動物實驗發(fā)現(xiàn)地骨皮有降低血糖[8]、促進胰島B細胞分泌胰島素[9]及降低血脂和改善免疫功能等作用[10]。本研究結(jié)果表明，地骨皮醇提取液可以降低實驗大鼠腎臟COX-2的表達從而對大鼠腎臟起保護作用，且高劑量組作用優(yōu)于低劑量組。地骨皮提取液中活性成分較多，其療效是多方面、多靶向的，故治療2型糖尿病以及糖尿病腎病的機制相對較復雜，確切機制尚不明確，有待于進一步研究。

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