利基林 林書(shū)瀚 唐艷萍 譚曉玉 黎遠(yuǎn)冬 鄧 偉 歐 超 容敏華 沈筱蕓 張力圖

肺癌是威脅人類健康最主要的惡性腫瘤之一，其生存率低。近年來(lái)，以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為靶標(biāo)的肺癌分子靶向治療已引起普遍關(guān)注。EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)和(或)發(fā)生突變，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制腫瘤生長(zhǎng)，并與新生血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)的藥物，以吉非替尼(gefitinib)為代表，在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)特別是在肺腺癌的治療中顯示出很好的抗腫瘤療效。有研究［1］表明:ECFR基因外顯子19～21突變與肺癌患者對(duì)吉非替尼的敏感性有關(guān)。因此，依據(jù)EGFR基因檢測(cè)結(jié)果選擇治療對(duì)象，通過(guò)篩選最適合的患者，進(jìn)行有針對(duì)性地靶向治療，從而可顯著提高藥物療效。目前已有肺癌EGFR基因突變的研究，但尚未有廣西壯族人群的相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)163例廣西壯族NSCLC患者的EGFR突變情況，并與國(guó)內(nèi)8個(gè)省市地區(qū)進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的廣西籍壯族NSCLC患者163例，其中男性111例，女性52例;年齡27～83歲，中位56.5歲。病理組織學(xué)分型:腺癌95例，鱗癌26例，腺鱗癌14例，其他28例。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 收集新鮮腫瘤組織:肺癌組織手術(shù)切除后快速放入液氮中凍存，然后置于-80℃低溫冰箱保存。

1.2.2 腫瘤組織病理石蠟切片:厚度為6μm，切片不少于10片，直接用干凈的鑷子將組織切片轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml離心管。

1.3 DNA提取

1.3.1 取新鮮腫瘤組織約50mg，用QIAGEN公司的DNeasy Blood＆Tissue Kit(商品序列號(hào):69504)提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度及濃度。

1.3.2 腫瘤組織行病理切片10片，用QIAGEN公司的 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(商品序列號(hào):56404)提取DNA，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度及濃度。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

采用擴(kuò)增耐突變系統(tǒng) (amplification refractory mutation system，ARMS-PCR)法擴(kuò)增 EGFR基因18、19、20及21外顯子。具體操作方法參照人類EGFR基因29種突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95℃ 5min;95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，循環(huán) 15 次;93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，循環(huán) 31 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變的檢出率

163例NSCLC標(biāo)本中共檢出EGFR基因突變73例，總檢出率為44.8%。其中外顯子18突變7例，占9.6%;外顯子19突變28例，占38.4%;外顯子20突變10例，占13.7%;外顯子21突變28例，占38.4%。以外顯子19及21突變較為多見(jiàn)。

2.2 EGFR基因突變與患者性別及組織類型的關(guān)系

本組男性患者(n=111)和女性患者(n=52)的EGFR基因突變率分別為38.7%(43/111)、57.7%(30/52)，女性患者的突變率明顯高于男性(P＜0.05)。95例腺癌中48例(50.5%)發(fā)生突變，26例鱗癌中8例(30.8%)突變;14例腺鱗癌中11例(78.6%)突變，其他組織類型的28例標(biāo)本中發(fā)生EGFR突變6例(21.4%)。

2.3 我國(guó)肺癌EGFR基因突變發(fā)生率的情況

本研究收集、整理近幾年我國(guó)臺(tái)灣和廣東、云南、湖南、上海、天津、北京、吉林等8個(gè)省市關(guān)于EGFR基因突變的報(bào)道資料，并與廣西壯族NSCLC患者EGFR基因突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和比較。檢測(cè)全國(guó)8個(gè)省市總計(jì)737例肺癌病例，結(jié)果有221例NSCLC EGFR 基因發(fā)生突變，突變率為 30.0%［2～8］。見(jiàn)表 1。本研究EGFR基因突變檢出率為44.8%，顯著高于文獻(xiàn)報(bào)道國(guó)內(nèi)8個(gè)省市的總體水平(30.0%)(χ2=13.29，P ＜0.05)。

表1 我國(guó)8個(gè)省、市肺癌EGFR基因突變情況

3 討論

臨床上使用較多的吉非替尼是一種新型的EGFR受體酪氨酸激酶口服抑制劑，作為分子靶向藥物，目前已成為治療非小細(xì)胞肺癌患者的一種有效措施，在NSCLC治療中有顯著的抗腫瘤作用。然而，國(guó)際多中心、隨機(jī)化臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示，吉非替尼的總體有效率僅為10% ～30%［9］，提示此類藥并非對(duì)所有肺癌患者都具有療效。有研究表明吉非替尼的療效與EGFR基因外顯子18、19、20和21(編碼胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)域)的突變有關(guān)?；蛲蛔兾挥贓GFR酪氨酸激酶活性區(qū)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的突變可以使活化信號(hào)更加強(qiáng)烈和持久，這也是EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑對(duì)EGFR基因突變的肺癌有效的原因［10］，并且還證明了EGFR突變與腫瘤的組織學(xué)類型、人種、性別等臨床特征有關(guān)。由此提示EGFR突變可作為預(yù)測(cè)對(duì)酪氨酸激酶抑制劑療效敏感的指標(biāo)，EGFR基因突變檢測(cè)對(duì)于臨床肺癌患者的個(gè)體化治療具有重要的參考價(jià)值。

本研究163例NSCLC中共檢測(cè)到EGFR基因突變73例，總突變率為44.8%。其中男性患者EGFR基因突變率為38.7%(43/111)，女性患者EGFR基因突變率為57.7%(30/52)。女性患者EGFR基因突變率顯著高于男性患者EGFR基因突變率(P＜0.05)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相同。EGFR突變具有性別差異，目前還沒(méi)有明確的解釋，其確切機(jī)制還需進(jìn)一步闡明，推測(cè)與雌激素有關(guān)。在NSCLC細(xì)胞株和小鼠移植模型的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)雌激素受體拮抗劑和吉非替尼間具有協(xié)同效應(yīng)，從而推測(cè)EGFR通路和雌激素受體間存在相互作用。本研究的突變主要發(fā)生在外顯子19和21，兩者均為28例突變，各占突變總數(shù)38.4%，這與我國(guó)EGFR基因突變的主要形式一致［9］。本研究還發(fā)現(xiàn)廣西壯族NSCLC患者EGFR基因突變主要以腺型(包括腺癌和腺鱗癌)為主，其突變發(fā)生率占該組織類型病例數(shù)的54.1%及突變總數(shù)的80.8%(59/73)，這與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道相似。

本研究受試對(duì)象均為廣西壯族NSCLC患者，為了進(jìn)一步探討EGFR基因突變與民族的差異性，我們將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)部分的相關(guān)報(bào)道(包括臺(tái)灣、廣東、云南、湖南、上海、天津、北京、吉林等)進(jìn)行了比較，并對(duì)這些省市共737例肺癌EGFR突變進(jìn)行綜合分析，結(jié)果該8個(gè)省、市肺癌 EGFR基因突變率為30.0%，與之前有學(xué)者［9］于2005年對(duì)北京、上海、云南、廣東及臺(tái)灣等5個(gè)省、市地區(qū)統(tǒng)計(jì)的突變率(34.0%)相近。本實(shí)驗(yàn)顯示，廣西壯族肺癌患者EGFR基因突變率(44.8%)，顯著高于我國(guó)8個(gè)省市地區(qū)肺癌EGFR基因突變的水平(P＜0.05)。我國(guó)民族眾多，各地肺癌EGFR基因突變存在差異，廣西壯族NSCLC患者EGFR基因突變率比我國(guó)部份地區(qū)EGFR基因突變水平相對(duì)較高，這可能與民族種類、遺傳背景、地域差異等因素相關(guān)，有關(guān)方面仍需深入探討和研究。

綜上，廣西壯族NSCLC患者的EGFR基因突變率顯著高于中國(guó)部份地區(qū)總體水平，且與患者性別、病理類型有關(guān)，主要見(jiàn)于女性、腺癌和腺鱗癌，這些是選用EGFR酪氨酸激酶抑制劑的優(yōu)勢(shì)人群。由于NSCLC中EGFR基因突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥物治療敏感性顯著相關(guān)，臨床上應(yīng)根據(jù)EGFR突變情況來(lái)選擇用藥，發(fā)揮分子靶向藥物的療效，使廣大肺癌患者受益。

［1］ Gazdar AF，Minna JD.Inhibition of EGFR signaling:all mtations are not created equal［J］.PLoS Med，2005，2(11)∶1085-1087.

［2］ Huang SF，Liu HP，Li LH，et al.High frequency of epidermal growth factor receptor mutations with complex patterns in non-small cell lung cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan ［J］.Clin Cancer Res，2004，10(24)∶8195-8203.

［3］ Qin BM，Chen X，Zhu JD，et al.Identification of EGFR kinase domain mutations among lung cancer patients in China:implication for targeted cancer therapy［J］.Cell Research，2005，15(3)∶212-217.

［4］ 奉水東，譚紅專，胡國(guó)斌，等.PCR-SSCP檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變的敏感性分析［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2008，23(4)∶307-310.

［5］ 姜 斌，朱冠山，劉 峰，等.中國(guó)人非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變的研究［J］.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(11)∶1148-1150.

［6］ 劉紅雨，李 穎，陳 鋼，等.187例非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變和擴(kuò)增的檢測(cè)及其臨床意義［J］.中國(guó)肺癌雜志，2009，12(12)∶1219-1228.

［7］ Mu XL，Li LY，Zhang XT，et al.Gefitinib-sensitive mutations of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain in chinese patients with non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(12)∶4289-4294.

［8］ 尹光浩，劉 偉，劉國(guó)津，等.非小細(xì)胞肺癌的EGFR表達(dá)與EGFR基因突變的比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(2)∶200-202.

［9］ 董強(qiáng)剛.肺癌靶向治療研究進(jìn)展與我國(guó)肺癌的EGFR基因突變概況［J］.腫瘤，2005，25(6)∶625-628.

［10］ Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，et al.Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97(5)∶339-346.