馬 倩，常 平，劉少云，熊 萍，羅成剛*，李彥東，劉 魁，蘇振剛，宋志美

（1.國家煙草專賣局煙草遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.山東臨沂煙草有限公司，山東 臨沂 276000；4.山東省煙草公司，濟(jì)南 250101；5.山東日照煙草有限公司，山東 日照 276800）

低溫冷害是北方煙區(qū)的主要?dú)庀鬄?zāi)害之一，是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因子，低溫脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，引起膜系統(tǒng)損傷，造成低溫傷害[1]。低溫對烤煙的影響一方面是抑制煙株的生長，另一方面是誘導(dǎo)早花，導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量的下降。張燕等[2]研究了在5 ℃低溫脅迫下PEG對煙苗抗冷性生理生化特性的影響，發(fā)現(xiàn)20% PEG浸種處理對提高煙草幼苗膜系統(tǒng)穩(wěn)定性及抗冷性物質(zhì)含量有一定作用。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)CaCl2浸種能夠提高煙草幼苗中結(jié)合鈣含量，增強(qiáng)對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固作用，減緩低溫對煙草幼苗細(xì)胞膜的傷害[3]。陳衛(wèi)國等[4]通過對低溫脅迫下5個(gè)烤煙品種一些生理指標(biāo)的測定，對這5個(gè)品種的耐寒差異性進(jìn)行了研究。本研究選用北方煙區(qū)種植的烤煙品種中煙100、NC82、K326為試驗(yàn)材料，旨在通過研究低溫條件下烤煙體內(nèi)脯氨酸含量、膜保護(hù)酶含量、丙二醛及相對電導(dǎo)率變化，探討不同烤煙品種的耐寒性生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，研究不同品種的敏感溫度和時(shí)間，為研究防御煙草低溫冷害提供理論依據(jù)，為煙草抗寒性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用烤煙品種中煙 100、NC82、K326為供試材料，種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2 材料處理

試驗(yàn)于 2009年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島溫室進(jìn)行。選擇籽粒飽滿的 3個(gè)品種種子在28～32℃的溫室播種，自然光照，統(tǒng)一栽培管理。當(dāng)植株長到五葉一心時(shí)進(jìn)入人工氣候箱進(jìn)行低溫處理，同時(shí)以常溫條件下的幼苗為對照（T）。低溫處理?xiàng)l件和處理時(shí)間為：2℃低溫條件下分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d（分別用T2-1、T2-2、T2-3表示）；5℃低溫條件下分別培養(yǎng)3 d、5 d、7 d（T5-3、T5-5、T5-7）；8℃低溫條件下分別培養(yǎng) 7 d、9 d、11 d（T8-7、T8-9、T8-11）。

1.3 測定方法

低溫處理完成后，各處理分別取生長一致的煙株，對第3片葉、第4片葉、第5片葉進(jìn)行抗寒指標(biāo)測定。用DDS-307型電導(dǎo)率儀測定外滲液的相對電導(dǎo)率[5]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[6]；愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）含量[7]；酸性茚三酮法測定脯氨酸（Pro）含量[6]。所有指標(biāo)測定均重復(fù)3次，取平均值（圖中數(shù)據(jù)為所有葉片各3次重復(fù)取樣后測定指標(biāo)的平均）。

2 結(jié) 果

2.1 低溫脅迫對不同烤煙品種相對電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率的變化能夠反應(yīng)出低溫脅迫對所測材料的質(zhì)膜的傷害程度。由圖1可知，在不同低溫處理?xiàng)l件下，3個(gè)品種的相對電導(dǎo)率變化趨勢一致，均明顯高于常溫對照。相同脅迫溫度不同脅迫時(shí)間，各品種的相對電導(dǎo)率均隨處理時(shí)間的增加逐步升高。相同脅迫時(shí)間不同脅迫溫度，各品種相對電導(dǎo)率隨溫度降低而增大。在2℃處理3 d時(shí)，相對電導(dǎo)率增加程度最明顯，中煙 100、NC82、K326分別較常溫對照增加了81.92%、86.11%、127.20%；在8℃處理7 d時(shí)，相對電導(dǎo)率增加程度最小，中煙 100、NC82 、K326分別較常溫對照增加了31.53%、34.79%、59.49%。品種間差異明顯，中煙100相對電導(dǎo)率的變化幅度最小，K326變化幅度最大，NC82居中。

圖1 低溫脅迫下煙草幼苗相對電導(dǎo)率的變化Fig.1 Trends of the relative electrical conductivities of the tobacco seedlings under chilling stress

2.2 低溫脅迫對不同烤煙品種丙二醛（MDA）的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低反應(yīng)了細(xì)胞膜脂過氧化水平，結(jié)果見圖2。煙草幼苗在低溫脅迫下MDA含量隨脅迫時(shí)間的延長逐漸增加，隨脅迫溫度的升高而減小，均高于對照。在對照及不同低溫脅迫下，K326的MDA含量一直高于中煙100和NC82，但3個(gè)品種的變化趨勢和幅度相同。3個(gè)品種在T2-3、T5-7時(shí)，MDA含量達(dá)到峰值，另外，中煙100在T5-5、T8-11變化幅度也較大，NC82在 T5-5、T2-2變化較大，K326在T2-2、T2-1變化較大。

圖2 低溫脅迫下煙草幼苗MDA的變化Fig.2 Trends of MDA contents of the tobacco seedlings under chilling stress

2.3 低溫脅迫對不同烤煙品種過氧化物酶（POD）的影響

POD是植物細(xì)胞內(nèi)清除自由基對細(xì)胞膜傷害的重要保護(hù)酶之一。在常溫條件下，3個(gè)品種的POD活性均保持較低水平。在2 ℃條件下，各品種POD活性均急速上升，中煙100上升幅度最大，且隨處理時(shí)間延長，上升幅度逐漸加大；NC82、K326的變化趨勢相同。較之于2 ℃，各品種在5 ℃的POD絕對值降低，變化趨勢相似。而在8 ℃條件下，POD變化趨勢平緩。這說明 POD活性隨低溫脅迫程度的加強(qiáng)而逐漸增大，耐寒性強(qiáng)的品種 POD活性上升幅度大于耐寒性弱的品種。3個(gè)品種在2 ℃各個(gè)處理和5 ℃培養(yǎng)7 d變化幅度較大，8 ℃變化較小。詳見圖3。

圖3 低溫脅迫下煙草幼苗POD活性的變化Fig.3 Changes of POD activity of the tobacco seedings under chiling stress

2.4 低溫脅迫對不同品種烤煙脯氨酸（Pro）的影響

脯氨酸在植物的低溫脅迫過程中，作為防脫水劑保護(hù)植物，同時(shí)，其作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脯氨酸含量的增加可以有效防止低溫脅迫對植物細(xì)胞膜的傷害[8]。由圖4可知，Pro含量隨處理溫度降低而升高，隨脅迫時(shí)間的延長而呈增加的趨勢。脅迫溫度的高低和脅迫時(shí)間的長短直接影響品種的脯氨酸含量。Pro含量在2 ℃上升速度最快，3個(gè)品種均在T2-3處理下達(dá)到峰值，中煙100和K326在5 ℃有明顯增加的趨勢，在8 ℃表現(xiàn)較為平緩，而NC82在8 ℃增加明顯。其中，中煙100的Pro隨脅迫處理的變化幅度尤為明顯，處理 T2-3比對照增加了212.91%，T5-7比對照增加了185.28%。K326變化幅度相對平緩，T2-3增加了 147.57%。T5-7增加了129.37%。

圖4 低溫脅迫下煙草幼苗脯氨酸含量的變化Fig.4 Changes of Pro content of the tobacco seedings under chiling stress

3 討 論

植物的抗寒性是植物體內(nèi)一系列生理生化過程綜合作用的結(jié)果，由相關(guān)的多基因調(diào)控，并受外界環(huán)境因子的影響或制約。在生理方面，許多研究證明，膜透性、MDA、POD、Pro均可作為鑒定植物耐寒性的指標(biāo)[9-10]。

生物膜是低溫傷害作用于植物細(xì)胞的原初部位，當(dāng)植物受寒時(shí)，其生物膜首先發(fā)生生物相變，生物膜的透性因此增大，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲[11]。因此，可以通過相對電導(dǎo)率的大小來反映植物的抗寒性；加之電導(dǎo)率不受休眠等因素的影響，許多研究者采用此法測定植物在低溫下的受害程度及植物的抗寒力。在本試驗(yàn)中，根據(jù)電導(dǎo)率的變化，3個(gè)品種均在T2-3、T2-2、T5-7、T5-5有低溫敏感性較強(qiáng)的表現(xiàn)；電導(dǎo)率增加程度與品種耐寒性強(qiáng)弱相關(guān)，耐寒性弱的K326增加幅度最大。

低溫脅迫下，植物產(chǎn)生過多活性氧，引起膜質(zhì)過氧化作用加劇，MDA含量升高，同時(shí)，細(xì)胞膜系統(tǒng)因膜質(zhì)過氧化作用而受損害，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加。從本試驗(yàn)中可看出，MDA含量變化趨勢與相對電導(dǎo)率相同，隨脅迫程度的增強(qiáng)而增加，3個(gè)品種在 2℃和 5℃有最強(qiáng)的低溫敏感性，中煙 100在T8-11也表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。

外界的脅迫會導(dǎo)致植物組織內(nèi)的活性氧超量造成氧化脅迫，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的活性氧代謝平衡，活性氧容易引發(fā)膜脂過氧化，造成膜的損傷。植物細(xì)胞中存在清除活性氧的保護(hù)酶系統(tǒng)，能有效地清除活性氧，阻止膜脂過氧化，從而使細(xì)胞膜免受傷害[12]。在本試驗(yàn)中，POD隨低溫脅迫程度的加重呈遞增的趨勢，但在T2-3處理下，NC82和K326增加程度降低，可能隨著脅迫程度加強(qiáng)，植株因低溫造成生理機(jī)能的下降和過氧化作用的加劇，膜保護(hù)酶系統(tǒng)已不能抵抗逆境傷害，植株的抗逆性降低，損傷加重，葉片干枯。

在逆境條件下，脯氨酸不僅是細(xì)胞質(zhì)中重要的滲透劑和防脫水劑，而且還是活性氧的清除劑，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，防止膜脂過氧化。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫情況下，根據(jù)3個(gè)不同低溫敏感性品種脯氨酸含量的變化，可以看出脯氨酸含量以及變化幅度耐寒性強(qiáng)的品種大于耐寒性弱的品種。3個(gè)品種在T2-3有最強(qiáng)低溫敏感性，其次是 T5-7，中煙 100和K326在T5-5、T2-2，NC82在T8-11、T8-9也有明顯變化。

4 結(jié) 論

綜合以上各生化指標(biāo)的變化趨勢可以看出，隨低溫脅迫程度增加，各品種的相對電導(dǎo)率、MDA、脯氨酸、POD均呈增加的趨勢；3個(gè)品種均在2 ℃和5 ℃處理下有較強(qiáng)的低溫敏感性，尤其2 ℃條件下培養(yǎng)3 d最強(qiáng)，其次是2 ℃條件下培養(yǎng)2 d及5 ℃條件下培養(yǎng)5 d和7 d，NC82和K326在2 ℃培養(yǎng)3 d時(shí)，植株已出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷；3個(gè)品種在8 ℃條件下處理7 d時(shí)，低溫敏感性最低。3個(gè)品種相比較，K326對低溫最敏感，NC82次之，中煙100對低溫最不敏感。

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