湯颯爽

(浙江省臺(tái)州市路橋中醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000)

細(xì)胞凋亡研究是近年來(lái)生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X－linked inhibitor of apoptosis，XIAP)屬于凋亡抑制蛋白家族IAPs中8個(gè)成員中的一員。XIAP是其中抑制凋亡最有力的成員，相對(duì)分子質(zhì)量為57000，基因定位于Xq25，是含有497個(gè)氨基酸的蛋白，N－末端含有3個(gè)BIR(baculovirus IAP repeat)結(jié)構(gòu)域(BIR1，BIR2，BIR3)。XIAP 通過(guò)與 caspase－3，caspase－6，caspase－7直接結(jié)合，進(jìn)一步抑制caspase的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡;BIR3區(qū)可直接與caspase－9前體－C－末端的亞單位結(jié)合，抑制caspase－9的激活[1];XIAP還可通過(guò)核因子－κB(NF－κB)途徑上調(diào) XIAP，c－IAP1，c－IAP2，抑制 caspases的激活，阻斷細(xì)胞凋亡。另外，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，雌、孕激素與其受體的相互作用在婦科惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，并在某種程度上反映患者的預(yù)后。米非司酮(mifepristone)系人工合成的類固醇激素，為強(qiáng)效受體水平的孕激素受體拮抗劑、糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，主要用于終止早期妊娠。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)米非司酮還具有抗腫瘤作用，可用于子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、婦科惡性腫瘤、腦膜瘤、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等疾病的治療。宮頸癌是婦女常見(jiàn)惡性腫瘤之一。為了研究XIAP在HeLa細(xì)胞中的作用，本研究利用共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況，用米非司酮誘導(dǎo)凋亡，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況，初步探討了XIAP對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響及其相互作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細(xì)胞系HeLa(購(gòu)自ATCC)，由遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代?？召|(zhì)粒pEGFPN1，pDsRed2－N1及其構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP－XIAP，pDsRed2－XIAP，由遵義醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存。LipofectionTM2000(Invitrogen公司)。米非司酮購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司;AnnexinⅤ－FITC購(gòu)自晶美公司，流式細(xì)胞儀(BDFACBCalibur公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取宮頸癌細(xì)胞系HeLa，培養(yǎng)于含10%新鮮小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃和5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒提取與鑒定

于LB培養(yǎng)液中加入硫酸卡那霉素(50 μg/mL);分別取150 μL pDsRed2－N1，pDsRed2－XIAP加入LB培養(yǎng)液中，于恒溫?fù)u床中搖菌，質(zhì)粒提取，存于－80℃冰箱中。采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量分析，根據(jù) A260/A280的比值反映DNA的純度，比值大于1.8且小于2.0時(shí)純度較高。重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)時(shí)，各試劑加入配制反應(yīng)體系，37℃孵育2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟:轉(zhuǎn)染前24 h，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞在培養(yǎng)板中生長(zhǎng)至60% ～80%。配置溶液A(4 μg質(zhì)粒DNA用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加至250 μL)和B(10 μL LipofectionTM2000用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加至250 μL)，室溫放置5 min，混勻 A液和 B液，室溫下放置 20 min。將500 μL復(fù)合物加入培養(yǎng)液中，37℃孵育6 h后，換成新鮮的有血清培養(yǎng)基，于37℃繼續(xù)孵育，24～48 h后可觀察到報(bào)告基因的表達(dá)。

對(duì)貼壁生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞分組:未處理組為常規(guī)培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞;藥物對(duì)照組為加米非司酮終濃度40μmol/L;空白對(duì)照A組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒無(wú)米非司酮處理，空白對(duì)照B組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒無(wú)米非司酮處理組;試驗(yàn)A組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒+米非司酮，試驗(yàn)B組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒+米非司酮。加藥組均于37℃培養(yǎng)48 h，加入米非司酮4 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞凋亡狀況與轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率檢測(cè)

細(xì)胞凋亡狀況:分別收集6組細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次;重懸于4×Binding Buffer，使細(xì)胞密度為 1×106/mL;于 100 μL細(xì)胞懸液中加入 AnnexinⅤ－FITC 5 μL，室溫避光孵育 15 min;加入磷酸鹽緩沖液 100 μL，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率:將轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒的細(xì)胞于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管;加入磷酸鹽緩沖液200 μL，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)電泳圖

pEGFP－XIAP，pDsRed2－XIAP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ酶切后，可見(jiàn)與XIAP片段大小相符的產(chǎn)物條帶，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)電泳圖

2.2 激光掃描共聚集顯微鏡圖像

未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合蛋白的HeLa細(xì)胞激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，圖像見(jiàn)圖2。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡圖像

由圖2 C可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合蛋白的HeLa細(xì)胞呈多邊形，在激光掃描共聚焦顯微鏡下見(jiàn)大量細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，pDsRed2－XIAP融合蛋白彌漫分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，在543 nm激發(fā)波長(zhǎng)下可見(jiàn)565 nm發(fā)射波長(zhǎng)下清晰的紅色熒光。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，pDsRed2－XIAP融合蛋白在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率為52.35%。

2.4 HeLa細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，米非司酮能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，XIAP可抑制由米非司酮誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡。

3 討論

研究宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)抑凋亡因子X(jué)IAP的特點(diǎn)以及藥物的干預(yù)作用，將為了解宮頸癌的發(fā)生機(jī)制、治療途徑提供基礎(chǔ)。Samuel等[2]通過(guò)細(xì)胞分級(jí)分離試驗(yàn)(cell fractionation experiments)發(fā)現(xiàn)，XIAP存在于HeLa細(xì)胞的胞漿內(nèi)，后來(lái)他們利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)部分HeLa細(xì)胞的胞核中也存在XIAP的蛋白表達(dá)。XIAP對(duì)caspase－3的抑制作用，主要通過(guò)結(jié)合caspase－3的底物結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制了caspase－3的活性，可通過(guò)BIR1與BIR2之間的接頭域抑制caspase－7的活性，另外還可通過(guò)BIR3結(jié)構(gòu)域抑制caspase－9，進(jìn)而在上游阻止了caspase－3的活性，達(dá)到阻斷細(xì)胞凋亡的作用[3－6]。XIAP還可以通過(guò)NF－κB途徑抑制細(xì)胞凋亡，通過(guò)上調(diào) XIAP，抑制caspase的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[1，7]。

表1 米非司酮藥物處理后HeLa細(xì)胞凋亡率的比較(，n=3)

表1 米非司酮藥物處理后HeLa細(xì)胞凋亡率的比較(，n=3)

注:與藥物對(duì)照組比較，＊P ＜0.05。

組別未處理組空白對(duì)照A組空白對(duì)照B組藥物對(duì)照組試驗(yàn)A組試驗(yàn)B組細(xì)胞凋亡率(%)0.06 ±0.04＊5.62 ±0.40＊9.29 ±2.45＊46.08 ±2.7348.68 ±0.6126.11 ±0.5＊處理方法未處理轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒米非司酮處理轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒+米非司酮處理轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒+米非司酮處理

本次研究發(fā)現(xiàn)，在米非司酮的誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染XIAP的HeLa細(xì)胞凋亡率比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Hela細(xì)胞凋亡率明顯降低，說(shuō)明XIAP可抑制由米非司酮誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡。筆者認(rèn)為，XIAP可能通過(guò)直接抑制 caspase－3，caspase－6或 caspase－7的激活，抑制 HeLa細(xì)胞凋亡;或通過(guò)其自身的BIR3，從上游阻斷caspase－9的催化活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率下降;還可能催化自身及靶蛋白，通過(guò)泛素化而降解，并降解與其結(jié)合的caspase[8]，從而增強(qiáng)抑制凋亡活性。

米非司酮的抗腫瘤作用，最初認(rèn)為主要與其抗孕激素作用有關(guān)。米非司酮通過(guò)以下多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用:通過(guò)調(diào)節(jié)bcl－2，bax，waf－1等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖;誘導(dǎo)細(xì)胞分化;通過(guò)拮抗藥源性或內(nèi)源性孕激素對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其mRNA的上調(diào)作用，抑制VEGF生成;調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，將細(xì)胞的增殖阻止于G1期;下調(diào)巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)蛋白阻斷神經(jīng)酞胺糖基化，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)相關(guān)化學(xué)治療藥物的敏感性。流行病學(xué)調(diào)查和臨床資料分析顯示，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌密切相關(guān)。80%的宮頸癌中人乳頭瘤病毒基因組與宿主基因組整合，使E6/E7癌性蛋白過(guò)度表達(dá)，從而分別使抑癌基因p53/pRb失活，細(xì)胞生長(zhǎng)失控發(fā)生癌變?；蚰艽龠M(jìn)HPV－16中E6/E7癌基因的轉(zhuǎn)錄，米非司酮可阻斷孕激素對(duì)癌基因的作用，米非司酮還能阻斷人乳頭瘤病毒基因組的整合與轉(zhuǎn)錄[9]。因此米非司酮在宮頸癌的治療中，尤其在阻斷人乳頭瘤病毒基因組與宿主基因組發(fā)生整合的早期宮頸癌變的治療中，將起到重要的作用。米非司酮是唯一應(yīng)用于臨床的孕激素拮抗劑，在藥物人工流產(chǎn)方面已取得滿意療效。為此，將米非司酮作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞株，觀察其對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，米非司酮能有效誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，米非司酮可望成為臨床上治療宮頸癌的輔助用藥，并且其在HeLa細(xì)胞中的作用機(jī)制可能與XIAP有關(guān)，但它們具體的結(jié)合方式、作用途徑尚需進(jìn)一步研究，還可以通過(guò)體內(nèi)研究包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)進(jìn)一步探討米非司酮對(duì)宮頸癌的治療作用。

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