范俊強，張軒萍，呂志杰，郭芬芬，張明升，武冬梅，劉 宇

(山西醫(yī)科大學藥理學教研室，山西太原 030001)

正常動脈血的pH值維持在7.35～7.45。機體組織和細胞必須處于適宜酸堿度的體液環(huán)境中才能進行正常的生命活動。研究表明［1-3］，細胞外pH值是維持心血管穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)因素，其改變可以影響血管張力，不同部位血管的細胞外pH改變對血管張力產(chǎn)生不同的影響。Li等［4］研究證實，堿中毒可引起大鼠大腦小動脈的血管收縮;Austin等［5］認為，胞外pH值的增加能引起靜息狀態(tài)下腸系膜動脈的收縮;Celotto等［6］最新研究表明，酸中毒能引起KCl預收縮的大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張。但是在靜息條件下，關于堿中毒對大鼠離體胸主動脈環(huán)的收縮作用尚未見報道。本實驗擬采用離體血管張力實驗方法，觀察不同pH值尤其是堿中毒條件下大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力的變化，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 KB-R7943，(2-［2-［4-(4-nitrobenzyloxy)Phenyl］ ethyl］isothioureamethanesulfon-ate)mesylate:TOCRIS公司，批號1B/84027;氨氯吡咪(amiloride，AM):Sigma公司，批號511K1351;氯化鉀(KCl，Potassium Chloride)，天津化學試劑三廠，批號070202;其余試劑為市售優(yōu)級純。

1.2 儀器與設備 PowerLab生物信號記錄分析系統(tǒng):澳大利亞Ad Instrument;張力換能器:FT-100，成都泰盟科技有限公司;數(shù)字式超級恒溫浴鍋:HH-501，常州國華電器有限公司;精密天平:BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;電子pH計:pHS-3C，上海雷磁儀器廠。

1.3 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，4月齡，體質量280～320 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(冀)2008-1-003。

1.4 大鼠離體胸主動脈環(huán)標本的制備 SD大鼠，斷頭處死后，迅速開胸，分離胸主動脈并剪下，放入4℃的生理鹽溶液(PSS)中，仔細剔除血管周圍的脂肪及結締組織后，剪成2～3 mm長的血管環(huán)。用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管環(huán)管腔，懸掛在浴管內(nèi)，下方固定，上方以一細鋼絲連于張力換能器，使用PowerLab系統(tǒng)記錄血管的張力變化。浴管內(nèi)含有通以 100%O2、pH 值為 7.4、37℃ PSS 液 5 ml。調前負荷至2 g，平衡1 h，其間每15 min更換1次營養(yǎng)液。所有血管環(huán)均用60 mmol·L-1-KCl PSS液刺激，待收縮穩(wěn)定后，開始正式實驗。

1.5 pH值改變對大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力的影響 在基礎張力狀態(tài)下，將浴管中pH 7.4的PSS液換為pH 8.0的浴液，連續(xù)更換3次，觀察0.5 h內(nèi)血管張力的變化，穩(wěn)定后用pH 7.4的PSS液沖洗3次。按此方法將浴液依次更換為pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0 以及 pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0，觀察不同pH環(huán)境下大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力的變化。待觀察完后用60 mmol·L-1KCl刺激該血管環(huán)，并與正式實驗開始之前的60 mmol·L-1KCl刺激的幅度相比較以檢測該血管的活性。以60 mmol·L-1KCl最大收縮幅度為100%，計算不同pH值下的收縮百分率。

1.6 pH=9.5時，外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放對大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力的影響 在基礎張力狀態(tài)下，將實驗組浴槽中的浴液更換為pH 9.5的無鈣PSS液，連續(xù)更換3次，觀察血管張力變化，達坪值后向浴槽中加入2.5 mmol·L-1的CaCl2觀察復鈣后血管張力的變化。計算不同組別間血管收縮百分率。

1.7 pH=9.5時，不同工具藥對大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后，向pH 7.4的PSS液中分別加入VEP(10-5mol·L-1)、KB-R7943(10-6mol·L-1)和 AM(10-4mol·L-1)，孵浴 15 min，將浴液更換為pH 9.5的PSS液，連續(xù)更換3次，并立即分別加入以上各工具藥，觀察不同工具藥對pH 9.5時血管張力的影響，對照組孵浴pH 9.5的PSS液。比較各組血管收縮百分率的差異。

2 結果

2.1 pH改變對大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力的影響 胞外酸性環(huán)境下隨pH值逐漸降低，大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力基本不變;堿性環(huán)境下隨pH值逐漸增加，其靜息張力明顯升高。pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0的最大收縮百分率(Emax)分別為(11.79±6.83)%、(30.25±3.57)%、(92.24±5.73)%、(110.85±7.78)%。見Fig 1。

Fig 1 Effects of pH on the resting tone in isolated thoracic aorta rings from adult rats(±s，n=6).

2.2 外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放在pH=9.5影響大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力中的作用 將浴液更換為pH=9.5的無鈣PSS液，大鼠胸主動脈最大收縮率為(5.36±0.61)%，加入 2.5 mmol·L-1的 CaCl2后，血管張力進一步恢復，其收縮率為(79.39±11.27)%。在靜息狀態(tài)下，孵浴VEP后，可明顯降低pH=9.5時胸主動脈環(huán)的收縮幅度，其Emax為(55.44±5.71)%。見Fig 2。

Fig 2 Effects of pH=9.5 on the resting tone in isolated thoracic aorat rings from adult rats in free-Ca2+PSS;and effects of CaCl2(2.5 mmol·L-1)，VEP(10-5mol·L-1)on the contraction induced by pH=9.5 in isolated thoracic aorta rings(±s，n=8).

2.3 Na+/Ca2+交換和 Na+/H+交換在pH=9.5影響大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力中的作用 與對照組比較，KB-R7943和AM對pH=9.5時胸主動脈環(huán)靜息收縮均有明顯的減弱作用(P＜0.01)。其Emax分別為(48.33±5.75)%、(32.12±4.45)%。見Fig 3。

Fig 3 Effects of KB-R7943(10-6mol·L-1)and AM(10-4mol·L-1)on the contraction induced by pH=9.5 in isolated thoracic aorta rings(±s，n=6).

3 討論

細胞外pH值是細胞環(huán)境的一個重要因素，在很多生理及病理條件下，細胞外pH值會有明顯改變［7］。當機體發(fā)生幽門梗阻、消化性潰瘍等疾病時易產(chǎn)生堿中毒，堿中毒在臨床上雖不及酸中毒多見，但同樣可引起全身各組織器官的功能紊亂。本研究結果顯示，胞外堿性環(huán)境下隨pH值逐漸增加，大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力逐漸升高。由此可見，堿中毒能直接影響胸主動脈的基礎張力，隨著堿中毒程度的加深，血管收縮明顯增強。提示，堿中毒有可能引起血壓的波動，引起組織器官的血流量異?；蚬δ芪蓙y，嚴重時將對生命構成威脅。本研究結果亦顯示，胞外酸性環(huán)境下隨pH值逐漸降低，大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力無改變。本研究采用的是在靜息狀態(tài)下的離體血管環(huán)實驗，即沒有給予任何預收縮劑刺激，這與Celotto等［6］的實驗結論“酸中毒能引起KCl預收縮的大鼠離體胸主動脈環(huán)舒張”并不矛盾，在沒有預收縮劑的前提下，酸中毒并不會引起靜息狀態(tài)下大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張。

Ca2+是引起血管平滑肌收縮的關鍵因子［8］，血管平滑肌收縮所需要的Ca2+源于細胞外流入和細胞內(nèi)釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，在無鈣條件下，pH=9.5仍可引起胸主動脈環(huán)收縮，表明在堿中毒情況下，存在細胞內(nèi)鈣釋放，將CaCl2加入浴管中引起的繼續(xù)收縮被認為是外Ca2+內(nèi)流的結果。VEP是L-型鈣通道阻斷劑，可通過抑制外鈣內(nèi)流降低胞質鈣濃度，進而調節(jié)血管張力［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，pH=9.5時胸主動脈環(huán)的基礎收縮作用可部分被VEP所抑制，表明通過抑制外鈣內(nèi)流可減弱血管收縮，但并不能完全消除pH=9.5時的血管收縮。

KB-R7943是一個具有相對選擇性的有效的Na+/Ca2+交換抑制劑。在雙向離子環(huán)境下，KBR7943 對 Na+/Ca2+交換具有雙向抑制作用［10］，既能抑制反向Na+/Ca2+交換(即Na+出Ca2+入)，又能抑制正向 Na+/Ca2+交換(即 Na+入 Ca2+出)。AM是一種保鉀利尿藥，可通過抑制Na+/H+交換，防止細胞內(nèi)堿化。Na+-H+交換體是存在于所有真核細胞中的完整膜蛋白，其生理功能在于參與細胞內(nèi)pH及容量的調節(jié)。李智等［11］研究證實，Na+/H+交換抑制劑可使細胞內(nèi)H+增多，降低細胞內(nèi)pH值，導致細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，進而舒張血管。本研究發(fā)現(xiàn)，KB-R7943和AM對pH=9.5時胸主動脈收縮均有明顯的減弱作用，表明Na+/Ca2+交換和Na+/H+交換均參與靜息狀態(tài)下pH=9.5時的胸主動脈收縮，與前述結果報道相符。

以上的研究結果表明，在堿性環(huán)境下，大鼠離體胸主動脈環(huán)靜息張力隨pH值增大而明顯升高，此作用依賴外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放，與Na+/Ca2+交換和Na+/H+交換均有關。

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