劉洪英，蘇翠玲，聶愛華，李 松，王莉莉

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.毒物藥物研究所、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

目前用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物主要是以神經(jīng)生長因子(NGF)為代表的神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors NTFs)，NGF是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性分子之一，能刺激神經(jīng)元生長和神經(jīng)纖維延長。但由于NGF類神經(jīng)營養(yǎng)因子其生物大分子的本質(zhì)，其臨床使用受到極大的限制。而小分子藥物具有穩(wěn)定性強、生物利用度高以及易透過血腦屏障等優(yōu)勢，一直是神經(jīng)營養(yǎng)和保護藥物研發(fā)的主要方向［1］。

上世紀90年代初，隨著FK506(一種新型高效的免疫抑制劑)在多種哺乳動物大腦神經(jīng)保護和促神經(jīng)再生作用的發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)FK506生物學(xué)效應(yīng)的FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding proteins，F(xiàn)KBPs)被證實以高水平存在于整個中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，并在神經(jīng)受損和疾病狀態(tài)下表達水平上調(diào)［1－3］。因此，以FKBPs為靶標(biāo)，發(fā)展非免疫抑制的神經(jīng)營養(yǎng)和保護劑成為國際上多家大型制藥機構(gòu)競相涉足的領(lǐng)域。

N308〔(3R)-4-(p-toluenesulfonyl)-1，4-thiazane-3-carboxylic acid-L-leucine ethyl ester〕是本課題組根據(jù)FKBP12(FKBPs家族的成員之一)以及其特異性配基FK506復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)，應(yīng)用計算機輔助藥物設(shè)計并合成的新結(jié)構(gòu)小分子化合物。電噴霧質(zhì)譜和X-射線晶體衍射的研究結(jié)果表明，N308能與重組表達的FKBP12特異性結(jié)合，并能形成非共價的復(fù)合物，但不具有 FK506的免疫抑制活性［4－6］。本實驗選擇雞胚背根神經(jīng)節(jié)生長、大腦皮層神經(jīng)細胞缺氧損傷和多巴胺損傷神經(jīng)元細胞等模型對N308的體外促神經(jīng)生長和神經(jīng)損傷保護作用進行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 雞胚，8 d齡(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所);Wistar孕大鼠，孕齡14～16 d;昆明種小鼠，♀，體質(zhì)量18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，動物合格證為SCXK(軍)2002-001。

1.2 試劑與藥品 N308，(3R)-4-(p-toluenesulfonyl)-1，4-thiazane-3-carboxylic acid-L-leucine ethyl ester，)由本課題組合成，經(jīng)核磁和質(zhì)譜確證其結(jié)構(gòu)，HPLC檢測其純度＞98%。FK506(CALBIOCHEM，美國)，6-羥多巴胺(6-OHDA)(Sigma公司);兔抗山羊酪氨酸羥化酶單克隆抗體(Santa cruz Biotechnology，Inc)，DMEM、F12、MEM 培養(yǎng)液，均為 Gibco公司產(chǎn)品;NGF，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院三所生產(chǎn)，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 雞胚背根神經(jīng)節(jié)生長實驗 本文對文獻［7］的方法進行了改進，基本過程如下:8 d雞胚，在解剖顯微鏡下?lián)荛_胸、腹部，暴露脊柱，分開兩側(cè)軟組織，摘去交感神經(jīng)鏈，用顯微鑷子摘取背根神經(jīng)節(jié)，接種于涂有大鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5～6個神經(jīng)節(jié)，置培養(yǎng)箱中，待神經(jīng)節(jié)貼壁2 h后，分別加入含0.15 μg·L－1NGF的無血清DMEM培養(yǎng)基2 ml及不同濃度的受試藥物(包括 FK506和 N308)。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，倒置相差顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)突起生長的狀況。按照神經(jīng)節(jié)四周突起生長的程度進行評分:0分:突起少于2～3個并且短于神經(jīng)節(jié)直徑;1分:突起稀且少;2分:突起較長或短但較密;3分:突起長且密。每濃度藥物接種2瓶，一般為8～12個神經(jīng)節(jié)。

1.4 大鼠中腦多巴胺神經(jīng)元細胞培養(yǎng)及6-OHDA損傷模型［8－10］孕期14～16 d的Wistar大鼠胎鼠，取其中腦內(nèi)側(cè)，經(jīng)0.03%胰酶37℃消化20 min，輕輕吹打，200目篩網(wǎng)過濾，計數(shù)，按每孔2.5×104個細胞/0.5ml接種于經(jīng)0.01%多聚-L-賴氨酸處理的48孔細胞培養(yǎng)板，接種液為F12∶MEM(1∶1)(含10%馬血清，5%胎牛血清);24h后換含1%N2的F12∶MEM培養(yǎng)液;72 h后加入含3 mg·L－1阿糖胞苷的培養(yǎng)液;24 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至第8天，加入陽性對照藥物FK506或不同濃度的受試化合物N308作用24 h后，用30 μmol·L－1的6-OHDA損傷細胞24 h，去除培養(yǎng)基。用預(yù)冷丙酮:甲醇(1∶1)固定細胞。室溫條件用1∶1 000稀釋的兔抗山羊酪氨酸羥化酶單克隆抗體(TH)進行免疫組化染色，計數(shù)每孔中陽性細胞數(shù)。

1.5 大腦皮層細胞培養(yǎng)及缺氧模型的建立［11］新生24 h的Wistar大鼠，取大腦皮層于預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中，剔除軟腦膜和血管，再移入含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM培養(yǎng)基中，剪碎、輕輕吹打成細胞懸液、200目篩網(wǎng)過濾，計數(shù)并稀釋至1×109·L－1，每孔 100μl接種于經(jīng) 0.01%多聚-L-賴氨酸處理的96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，以后每2～3 d換液1次。細胞培養(yǎng)至第3天，加入終濃度3 mg·L－1的阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細胞的生長，24 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

大腦皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)至6～8 d，分別設(shè)正常對照組(不含血清的低糖DMEM)、無糖Earle’s液對照組、損傷模型組和給藥組。給藥組在損傷前24 h 分別加入終濃度為 0.3、1、3、10 及 30 nmol·L－1的N308和陽性對照 FK506，作用24 h后吸去含化合物的原培養(yǎng)液，用無糖Earle's液洗2遍，每孔加入含連二亞硫酸鈉32 mmol·L－1的無糖Earle's液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。去除含連二亞硫酸鈉的無糖Earle's液，用不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基洗1遍并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法測定細胞存活率。藥物保護率/%=(給藥組－損傷模型組)/正常對照組×100%

Fig 1 N308 promotes the neurite outgrowth of chick embryo dorsal root ganglion(×200)

2 結(jié)果

2.1 N308對體外培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)突起生長的影響 相差顯微鏡下觀察可見，無NGF的培養(yǎng)條件下，雞胚背根神經(jīng)節(jié)呈球形、橢圓形狀，無突起長出;當(dāng)培養(yǎng)基含有0.15 μg·L－1NGF時，背根神經(jīng)節(jié)周圍有極少的突起生長;化合物N308和陽性對照FK506，在培養(yǎng)基含有 0.15 μg·L－1NGF 的條件下，能夠協(xié)同NGF促進背根神經(jīng)節(jié)生長，促進神經(jīng)節(jié)周圍神經(jīng)纖維的生長，出現(xiàn)明顯的突起向四周生長(Fig 1)。評分結(jié)果顯示N308在10～1000 pmol·L－1濃度范圍內(nèi)對雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維生長呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系(Fig 2)。

2.2 N308對6-OHDA損傷大鼠中腦多巴胺神經(jīng)元的保護作用 采用免疫組化染色的方法對體外培養(yǎng)的大鼠中腦多巴胺神經(jīng)元細胞的TH的分布進行觀察，結(jié)果表明，30 μmol·L－16-OHDA 與細胞共孵育24 h后，多巴胺神經(jīng)細胞表現(xiàn)為神經(jīng)突起減少或消失，TH陽性細胞數(shù)明顯減少。而0.5 μmol·L－1N308和陽性化合物FK506預(yù)處理組細胞的神經(jīng)突起較6-OHDA損傷對照組細胞明顯增長，TH陽性細胞數(shù)明顯增多，表明N308對6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷有明確的保護作用(Fig 3，4)。

Fig 2 Effect of N308 on the neurocyte outgrowth of chick embryo dorsal root ganglion(±s，n=8～12)

Fig 3 Effect of N308 on dopaminergic neurons against 6-OHDA toxicity(×200)

2.3 N308對連二亞硫酸鈉誘發(fā)的大鼠大腦皮層細胞缺氧損傷的保護作用 連二亞硫酸鈉處理體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮層細胞可造成細胞的化學(xué)缺氧。32 mmol·L－1連二亞硫酸鈉處理4 h后，培養(yǎng)的大腦皮層細胞存活率為22.47%，表明大鼠大腦皮層細胞缺氧損傷嚴重。分別用 0.3、1及3 nmol·L－1的N308和陽性藥FK506預(yù)先給藥24 h明顯提高大腦皮層神經(jīng)細胞的存活率(Fig 5)，說明N308濃度依賴地對抗亞二連硫酸鈉誘發(fā)的大腦皮層神經(jīng)細胞缺氧損傷作用。

Fig 4 Effect of N308 on dopaminergicneurons against 6-OHDA toxicity(±s，n=3)

Fig 5 Effect of N308 on hypoxia injury induced by Na2S2O4in cerebral cortex cells(±s，n=3)

3 討論

本實驗采用經(jīng)典的促神經(jīng)生長和保護因子的評價方法，評價了本室發(fā)現(xiàn)的新型非免疫活性的FKBP12小分子配基N308體外促神經(jīng)生長以及對抗缺氧和多巴胺損傷的保護作用，發(fā)現(xiàn)N308在體外具有明確的促雞胚背根神經(jīng)生長的作用，同時能夠?qū)够瘜W(xué)缺氧誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞損傷和6-OHDA誘導(dǎo)的大鼠中腦多巴胺神經(jīng)元細胞損傷的作用。

FKBPs在神經(jīng)系統(tǒng)含量豐富，與［3H］FK506的結(jié)合較免疫組織如胸腺及其他周圍器官包括脾臟、心臟、腎臟、肝臟和肺高10～50倍［12］。已證明，F(xiàn)KBPs配基是目前已知的唯一的具有促神經(jīng)生長的有機小分子，具有促進PC12細胞和背根神經(jīng)突起的生長，以及體內(nèi)在周圍神經(jīng)損傷后促進功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的作用［3－4］。然而，與神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性相比，F(xiàn)KBPs配基作用較弱，往往要依賴于神經(jīng)生長因子，因此，對其生物活性的觀察要求更嚴格的實驗條件的控制。雞胚背根神經(jīng)突起生長實驗是體外評價神經(jīng)營養(yǎng)因子活性的經(jīng)典方法。孵化7～8 d的雞胚背根神經(jīng)節(jié)，正逢細胞增殖期，即神經(jīng)母細胞向神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，對NGF最為敏感，易于觀察外源促神經(jīng)生長分子的生物活性;本實驗為了有效觀察FKBPs配基的促神經(jīng)生長作用，選擇孵化7～8 d的雞胚背根神經(jīng)節(jié)，并確定僅有微弱促背根神經(jīng)節(jié)生長的 NGF濃度為0.15 μg·L－1，這樣既能維持神經(jīng)節(jié)的生長，又能顯現(xiàn)化合物的效果。實驗結(jié)果表明，與陽性藥物FK506相同，在維持濃度的NGF存在下，新型FKBPs配基N308在體外具有明確的促神經(jīng)生長作用，并在10～1 000 pmol·L－1濃度范圍呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。而該作用是依賴于基礎(chǔ)濃度的NGF存在，這與文獻報道的FKBPs配基作用一致［7，9－10］。直至目前，F(xiàn)KBPs 配基啟動的促神經(jīng)突起生長作用的機制尚不清楚。

FKBPs在神經(jīng)系統(tǒng)高水平表達并與Calcineurin(鈣依賴的絲氨酸/色氨酸蛋白磷酸酶)位于相同部位。由于NO合成酶(NOS)是通過Calcineurin脫磷酸化調(diào)節(jié)，加速NO的合成。因而激發(fā)了人們研究FKBPs配基是否引起神經(jīng)保護作用。在體外皮質(zhì)細胞培養(yǎng)中，F(xiàn)K506具有對抗NMDA興奮性毒性的作用;此外，有報道 FK506和非免疫抑制的FKBP12配基GPI1046具有預(yù)防6-OHDA誘導(dǎo)的小鼠紋狀體損傷的作用、對抗雙氧水對神經(jīng)細胞的損傷作用［8－9］。然而保護作用機制可能存在FKBPs依賴和非依賴的機制，即抑制NO產(chǎn)生和通過增加谷胱苷肽含量兩種途徑［6，9］。本實驗采用體外原代培養(yǎng)的大鼠DA能神經(jīng)元和大腦皮層細胞作為實驗對象，觀察了N308對6-OHDA和缺糖缺氧損傷神經(jīng)細胞的影響。結(jié)果表明N308在上述兩種損傷模型上均具有保護作用，其有效濃度與FK506相當(dāng)，明顯高于促神經(jīng)生長作用的有效濃度，與文獻報道基本一致。其原因可能是促神經(jīng)生長和保護作用機制有所不同［9－10］。N308 是一個新型非免疫活性的 FKBP12小分子配基，因此可以避免FK506體內(nèi)給藥的免疫抑制作用。N308具有的神經(jīng)保護和促神經(jīng)生長作用可能為神經(jīng)退行性疾病的治療提供一個新的選擇，其體內(nèi)的有效性有待進一步評價。

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