許成芳，李小毛，李 田，王小韻

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510630)

PTEN基因(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten)作為一個(gè)抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)子宮內(nèi)膜癌中都存在PTEN基因的突變，是目前已知的子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因［1］。紫杉醇是一種新型的治療子宮內(nèi)膜癌的化療藥物，其抗腫瘤機(jī)制主要是引起細(xì)胞DNA產(chǎn)生不可修復(fù)的損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［2］。紫杉醇在臨床上的應(yīng)用日益廣泛，但是其非特異性的毒副作用以及晚期或復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌患者對(duì)其耐藥性的增加大大限制了紫杉醇在臨床上的應(yīng)用［3］。因此，本研究擬通過(guò)比較紫杉醇對(duì)不同PTEN基因狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用，探討PTEN基因在影響紫杉醇療效中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及慢病毒載體 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞由廣州市中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。人PTEN基因RNAi慢病毒載體和PTEN基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;兔抗 p-AKT單抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;鼠抗人PTEN購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司;鼠抗β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司;蛋白分子量Marker購(gòu)自日本Fermentas公司;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa及 HEC-1A培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件在5%CO2、飽和濕度及37℃下進(jìn)行。

1.3.2 PTEN基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體和小分子干擾RNA表達(dá)慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，Ishikawa細(xì)胞以2.5×105/孔，HEC-1A細(xì)胞以5×104/孔鋪于6孔板中。Ishikawa細(xì)胞按MOI為10，HEC-1A細(xì)胞按MOI為50進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，分別設(shè)對(duì)照組和目的基因病毒轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染4 h后將無(wú)血清培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn) 以5×103/孔接種細(xì)胞于96孔板中，培養(yǎng)24 h后分別按濃度梯度予紫杉醇:0.1、1、5、10、20、50、100 mg·L－1，并分別于加藥 24、48、72 h后檢測(cè)。每孔加入MTT溶液20 μl繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取每孔的吸光度(A)值，繪制細(xì)胞增殖曲線。細(xì)胞存活率/%=A試驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%，根據(jù)Sigma-plot軟件計(jì)算紫杉醇24 h的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次、每時(shí)段均設(shè)3復(fù)孔。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 按6 mg·L－1濃度紫杉醇作用于細(xì)胞24 h，胰酶消化，1 000 r·min－1離心5 min去除培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，棄上清，收集細(xì)胞。100 μl PBS重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-PE和7-AAD試劑各2.5 μl，室溫中避光孵育30 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，Becton-Dickinson公司)檢測(cè)。培養(yǎng)基+細(xì)胞組作為空白對(duì)照組。結(jié)果用Cell Quest軟件分析。

1.3.5 Western blot檢測(cè) 提取細(xì)胞蛋白，BCA法定量，取等量樣本上樣于10%SDS-PAGE凝膠電泳，100 V，電泳至溴酚藍(lán)達(dá)分離膠，加大電壓至200 V，直至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠的底部，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。結(jié)果用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，以±s表示，兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，各樣本均數(shù)間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖情況的變化 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，紫杉醇(6 mg·L－1)可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，包括未轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞(PTEN陽(yáng)性)和Ishikawa細(xì)胞(PTEN陰性)以及轉(zhuǎn)染后的HEC-RNAi細(xì)胞(PTEN陰性)和Ishikawa-PTEN細(xì)胞(PTEN陽(yáng)性)的生長(zhǎng)，其抑制率與時(shí)間、劑量成正相關(guān)(Fig 1)。

與 Ishikawa細(xì)胞(PTEN陰性)相比，過(guò)表達(dá)PTEN基因(Ishikawa-PTEN細(xì)胞)可明顯降低紫杉醇作用24 h的 IC50，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在HEC-1A細(xì)胞中，敲除PTEN基因后，紫杉醇作用24 h的IC50明顯升高(P＜0.05)。

2.2 紫杉醇作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率的變化

用紫杉醇(6 mg·L－1)作用于不同PTEN基因狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理前后細(xì)胞的凋亡率變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未用藥組相比，紫杉醇處理后細(xì)胞凋亡率明顯升高。對(duì)比紫杉醇處理不同PTEN基因狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Ishikawa-PTEN細(xì)胞的凋亡率(55.00% ±5.86%)明顯高于 Ishikawa細(xì)胞(13.35% ±1.78%)，P＜0.05;HEC-1A細(xì)胞的凋亡率(21.70%±2.37%)明顯高于 HEC-1A-RNAi的凋亡率(13.35% ±1.78%)，P＜0.05(Fig 2)。以上結(jié)果提示，PTEN基因陽(yáng)性的細(xì)胞對(duì)紫杉醇更敏感。

Fig 1 Effects of taxol on proliferation in endometrial cancer cells(±s，n=3)

2.3 紫杉醇作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中磷酸化AKT及Caspase-3的變化 Western blot結(jié)果顯示，與Ishikawa細(xì)胞(PTEN陰性)相比，過(guò)表達(dá)PTEN基因(Ishikawa-PTEN細(xì)胞)可以明顯降低磷酸化AKT蛋白的表達(dá)，上調(diào)Caspase-3的蛋白水平;而在HEC-1A細(xì)胞中，敲除 PTEN基因后(HEC-1A-RNAi細(xì)胞)磷酸化AKT蛋白的表達(dá)上升，Caspase-3的蛋白水平下降。紫杉醇(6 mg·L－1)作用24 h均可明顯下調(diào)細(xì)胞的磷酸化AKT蛋白水平以及上調(diào)Caspase-3的蛋白水平，但在PTEN陽(yáng)性的細(xì)胞中磷酸化AKT以及Caspase-3蛋白變化更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig 3)。

3 討論

紫杉醇在子宮內(nèi)膜癌化療中的應(yīng)用日益廣泛，但許多復(fù)發(fā)或晚期子宮內(nèi)膜癌患者對(duì)紫杉醇作用不敏感，其原因尚不清楚。因此，除了常規(guī)治療外，選擇分子標(biāo)記物來(lái)預(yù)測(cè)或者改善子宮內(nèi)膜癌對(duì)紫杉醇敏感性，將為臨床合理選用化療藥物提供理論依據(jù)［6－7］。PTEN基因是迄今發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，其突變和雜合性缺失常見于多種晚期原發(fā)性惡性腫瘤。目前的研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的突變率最高，常發(fā)生在子宮內(nèi)膜癌病變的早期階段［8－9］。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建人PTEN基因RNA干擾和PTEN基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體，分別建立PTEN基因敲除和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，從而探討PTEN基因在紫杉醇治療子宮內(nèi)膜癌中的作用。

Fig 2Effects of taxol on apoptosis in endometrial cancer cells(±s，n=3)

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。尤其是在PTEN基因陽(yáng)性的細(xì)胞，其作用更加明顯。與PTEN陰性的細(xì)胞相比，紫杉醇在PTEN陽(yáng)性細(xì)胞的IC50明顯降低，細(xì)胞抑制率增加，細(xì)胞凋亡率增加，提示PTEN基因能增強(qiáng)紫杉醇的細(xì)胞毒性。

Fig 3 Effects of taxol on the expression of P-AKT and Caspase-3 in endometrial cancer cells(±s，n=3)

PTEN基因能夠增強(qiáng)紫杉醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制尚未闡明。有研究表明，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)是PTEN作用的下游信號(hào)通路，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療過(guò)程中起重要作用［11－12］。尤其是 AKT通路，其與腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，抑制該通路可增加腫瘤化療或放療的敏感性［13－14］。我們的研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后，磷酸化AKT蛋白的表達(dá)下降，Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，提示紫杉醇可能是通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路，增加Caspase-3蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)子功能內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。有趣的是，這種變化在PTEN陽(yáng)性的細(xì)胞中更加明顯。將PTEN基因敲除后，磷酸化AKT蛋白水平增加，Caspase-3的表達(dá)下降;而PTEN缺失的細(xì)胞重新表達(dá)PTEN蛋白后，則出現(xiàn)相反的改變。以上結(jié)果提示PTEN基因是通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)途徑增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)凋亡的作用的。

因此，子宮內(nèi)膜癌患者化療選用細(xì)胞毒性藥物-紫杉醇時(shí)，應(yīng)考慮患者的PTEN基因狀態(tài)，這將為臨床個(gè)體化用藥提供新的資料。同時(shí)，PTEN基因的導(dǎo)入可提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性，PTEN基因有望成為治療的子宮內(nèi)膜癌的新的靶點(diǎn)。

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