王春波，孫 霞，李金蓮，韓彥弢，陳雪紅，謝 靖

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266071;2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)是線粒體內(nèi)膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員之一，在哺乳動(dòng)物多種組織中廣泛表達(dá)，通過使氧化磷酸化解偶聯(lián)，降低線粒體內(nèi)膜電勢(shì)，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，參與多種組織的抗氧化應(yīng)激損傷［1－2］。研究已證實(shí)［3］，UVA主要是通過誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)ROS過度積累而引發(fā)凋亡的，高濃度的ROS極易氧化損傷線粒體內(nèi)膜、DNA等超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體功能喪失，最終引起細(xì)胞氧化損傷。紫外線照射對(duì)UCP2是否會(huì)有影響，UCP2在UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷中有何作用?目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察UVA照射后HaCaT細(xì)胞UCP2表達(dá)的變化，并應(yīng)用海洋抗氧化劑扇貝多肽(polypeptide from Chlamys farreri，PCF)，觀察其對(duì) UVA照射后 ROS釋放、UCP2表達(dá)及線粒體凋亡途徑、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性的影響，探究扇貝多肽對(duì)UVA損傷HaCaT細(xì)胞線粒體功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材 PCF由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所分離純化;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;UCP2多克隆抗體購自Millipore公司;Apaf-1、Cyt C多克隆抗體購自Cell Signaling公司;β-actin抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;線粒體提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性定量檢測(cè)試劑盒購自Genmed公司。紫外輻照儀由北京師范大學(xué)光電儀器廠制造。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT由韓國延世大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室惠贈(zèng)。HaCaT細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清、1 ×105U·L－1青霉素鈉、1 ×105U·L－1硫酸鏈霉素)，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及UVA照射 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分組:① 對(duì)照組:正常培養(yǎng)的細(xì)胞;②模型組:UVA輻射損傷的細(xì)胞;③PCF組:預(yù)先在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的PCF預(yù)孵育2 h后再經(jīng)UVA照射。PCF設(shè)有 5.69、2.84和 1.42 mmol·L－13個(gè)濃度。

UVA照射劑量為8 J·cm－2。將細(xì)胞接種于6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，融合達(dá)0.80以上時(shí)，用鋁箔蓋住對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行UVA照射。照射時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，用D-Hanks沖洗2次，每孔入2 ml D-Hanks液覆蓋細(xì)胞。照射結(jié)束后，換新鮮培養(yǎng)液根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)適宜時(shí)間。

1.4 電子自旋共振 (electron spin resonance，ESR)檢測(cè)ROS釋放量 每組取1×108細(xì)胞，用含10 mmol·L－1PBN、2 mmol·L－1DETAPAC 的磷酸HEPES緩沖液冰浴勻漿，離心后取上清1.4 ml，分別加入0.5 mol·L－1Na2S2O4，0.6 mol·L－1DETC，10 mmol·L－1L-Arg，0.3 mol·L－1FeSO4各 30 μl，37℃水浴30 min;迅速放于冰上，加入0.3 ml乙酸乙酯，振蕩后離心8 min，取上清測(cè)定。檢測(cè)條件:中心磁場(chǎng)3385 G，微波功率20 mW，掃寬400 G，放大倍數(shù)4×105。

1.5 Western blot 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)UVA照射處理后，棄去舊培養(yǎng)液用預(yù)冷的D-Hanks沖洗3次后將培養(yǎng)板置于冰上，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞加100 μl裂解液冰上裂解30 min，裂解充分后，將細(xì)胞刮下置于1.5 ml離心管中，4℃、12 000×g離心 5 min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白質(zhì)。線粒體及胞質(zhì)蛋白的提取按說明書操作，用于Cyt C釋放及線粒體UCP2表達(dá)、呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ活性的檢測(cè)。

BCA法測(cè)定蛋白濃度，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后將NC膜置于封閉液中室溫封閉1～2 h，一抗(β-actin 1 ∶400，Apaf-1、Cyt C、UCP2 均為 1∶1 000)4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次5 min;按照1∶1 000的比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃孵育40 min;TBST洗滌3次，每次5 min。DAB顯色，凝膠分析軟件Quantity one進(jìn)行灰度分析。

1.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并處理細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，加入終濃度10 mg·L－1的 Rh123，37℃ 避光孵育 30 min，PBS 洗滌2次以去除未結(jié)合的染料，加 PBS 300 μl，混勻，流式細(xì)胞儀測(cè)定其平均熒光強(qiáng)度。

1.7 紫外分光光度法檢測(cè)呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ的活性

取線粒體蛋白 5～10 μg，于 －20℃/20℃ 反復(fù)凍融3次以達(dá)到最大反應(yīng)速度，按照試劑盒說明書測(cè)定340 nm處NADH的吸收值表示呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ的活性。

2 結(jié)果

2.1 UVA照射HaCaT細(xì)胞后UCP2蛋白表達(dá)的變化 UVA 照射后不同時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、8、12、24 h)收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)UVA照射后HaCaT細(xì)胞線粒體中UCP2蛋白表達(dá)的經(jīng)時(shí)變化。結(jié)果如Fig 1所示，正常組細(xì)胞線粒體UCP2表達(dá)很少，UVA照射后1 h未見明顯變化，照射后3 h表達(dá)增加并達(dá)到高峰，隨后又逐漸下降，24 h時(shí)表達(dá)水平與1 h基本一致。

Fig 1 Changes of UCP2 protein expression after UVA radiation in mitochondria of HaCaT cells

Fig 2 Effect of PCF on ROS release in HaCaT cells after UVA radiation(±s，n=3)

2.2 PCF對(duì)UVA照射后HaCaT細(xì)胞ROS釋放的影響 分別于UVA照射后1、3、12、18 h收集細(xì)胞。PCF組于照射前 2 h加入 2.84 mmol·L－1PCF。ESR檢測(cè)ROS的釋放，ROS釋放量以3個(gè)釋放波峰值的平均值表示。結(jié)果如Fig 2所示，UVA照射后1 h ROS即迅速升高，隨后有所降低。PCF對(duì)各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)ROS的釋放均有抑制作用，12 h和18 h作用最強(qiáng)。

2.3 PCF對(duì)UVA照射后HaCaT細(xì)胞UCP2蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在UVA照射后3 h UCP2表達(dá)為高峰，因此實(shí)驗(yàn)選用3 h作為觀察PCF作用的時(shí)間點(diǎn)。UCP2表達(dá)水平以UCP2與βactin光密度比值表示，結(jié)果如Fig 3所示，UVA照射后3h線粒體UCP2表達(dá)量明顯增加，與正常組相比差異有顯著性(P＜0.01);PCF預(yù)孵育能降低UCP2的表達(dá)，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.01)，且有隨劑量增加作用增強(qiáng)的趨勢(shì)。ROS抑制劑NAC預(yù)孵育亦明顯降低了UCP2的表達(dá)。

Fig 3 Effect of PCF on UVA-induced UCP2 protein

2.4 PCF對(duì)UVA照射后HaCaT細(xì)胞線粒體膜電位的影響 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示(Fig 4)，UVA照射后，HaCaT細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強(qiáng)度明顯下降(P＜0.01)，表明線粒體跨膜電位下降，提示UVA照射對(duì)HaCaT細(xì)胞線粒體膜造成了損傷，經(jīng)過PCF預(yù)孵育的細(xì)胞線粒體跨膜電位有明顯的提高。

2.5 PCF對(duì)UVA照射后HaCaT細(xì)胞Cyt C蛋白表達(dá)的影響 Western blot分別檢測(cè)HaCaT細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體內(nèi)Cyt C的蛋白表達(dá)水平。Fig 5結(jié)果顯示，UVA照射HaCaT細(xì)胞后18 h，與正常對(duì)照組相比，模型組HaCaT細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt C表達(dá)降低，而胞質(zhì)內(nèi)Cyt C表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，說明UVA照射誘導(dǎo)了HaCaT細(xì)胞CytC的釋放。與模型組相比較，PCF抑制了UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt C的減少和胞質(zhì)內(nèi)Cyt C表達(dá)的增加，表明PCF可抑制Cyt C從線粒體向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移。

Fig 4 Effect of PCF on mitochondria membrane

Fig 5 Effect of PCF on UVA-induced Cyt C release in HaCaT cells(±s，n=3)

2.6 PCF對(duì)UVA照射后HaCaT細(xì)胞Apaf-1蛋白表達(dá)的影響 UVA照射后18 h收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Apaf-1蛋白表達(dá)水平，以Apaf-1與β-actin光密度比值表示。Western blot結(jié)果顯示(Fig 6)，UVA模型組與正常對(duì)照組相比較，Apaf-1蛋白水平明顯增加(P＜0.01)，與UVA模型組相比，除低劑量PCF組(1.42 mmol·L－1)外，中、高劑量PCF均能明顯抑制Apaf-1的表達(dá)(P＜0.01)。

Fig 6 Effect of PCF on UVA-induced Apaf-1 expression in HaCaT cells(±s，n=3)

2.7 PCF對(duì)UVA照射后HaCaT細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ活性的影響 紫外分光光度法檢測(cè)呼吸鏈復(fù)合酶I的活性，結(jié)果顯示，UVA模型組呼吸鏈復(fù)合酶I的活性明顯下降(P＜0.01)，預(yù)先加入PCF孵育的各組細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合酶I活性的下降被抑制，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of PCF on the activity of complexⅠof respiratory chain in HaCaT cells after UVA radiation(±s，n=9)

Tab 1 Effect of PCF on the activity of complexⅠof respiratory chain in HaCaT cells after UVA radiation(±s，n=9)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs UVA model;△P＜0.05 vs 1.42 mmol·L－1PCF

Group Complex Ⅰ activity/μmol·min－1·g －1 Normal 63.5 ±4.1 UVA Model 44.9 ±4.8##PCF 1.42 mmol·L－1 53.2 ±3.5*PCF 2.84 mmol·L－1 60.1 ±1.6＊＊△PCF 5.68 mmol·L－1 62.8 ±3.6＊＊△

3 討論

線粒體主要功能之一是通過氧化磷酸化作用，把各種能量轉(zhuǎn)換成ATP。線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是位于線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體，具有使線粒體呼吸鏈與ADP的磷酸化解偶聯(lián)的作用［1］。研究表明，UCP2參與了ROS的調(diào)控:外源產(chǎn)生的過氧化物能夠在細(xì)胞體系中激活UCP2依賴的質(zhì)子漏［4］，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜電勢(shì)下降，降低了ROS的水平，限制了線粒體內(nèi)過氧化物的產(chǎn)生，以保護(hù)機(jī)體免受過氧化損傷。

既然ROS在UVA照射后會(huì)大量產(chǎn)生，UVA照射是否會(huì)影響UCP2的表達(dá)還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測(cè)UVA照射HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)線粒體中UCP2蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常HaCaT細(xì)胞表達(dá)UCP2很少，UVA照射后細(xì)胞線粒體UCP2表達(dá)升高，3 h即達(dá)最高值，隨后逐漸下降。采用ROS抑制劑NAC預(yù)孵育HaCaT后再經(jīng)UVA照射，UCP2表達(dá)明顯降低。參考文獻(xiàn)報(bào)道并分析認(rèn)為［1－2，4］，UVA 照射后產(chǎn)生的 ROS 或過氧化物是刺激UCP2表達(dá)的因素之一，UCP2表達(dá)的增高增強(qiáng)了線粒體呼吸鏈與ADP磷酸化的解偶聯(lián)作用，從而降低線粒體內(nèi)膜質(zhì)子電化學(xué)梯度，ROS產(chǎn)生減少。HaCaT細(xì)胞通過增加UCP2的表達(dá)來抑制UVA誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，是一種自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

扇貝多肽是自海洋貝類廢棄物中提取的海洋抗氧化多肽，可抑制 UVA誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞凋亡［5－6］。實(shí)驗(yàn)中采用ESR技術(shù)直接檢測(cè)ROS的釋放情況，證實(shí)了PCF對(duì) UVA引起的ROS的產(chǎn)生和釋放有明顯的抑制作用。Western blot檢測(cè)PCF對(duì)UCP2表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同劑量 PCF后，UCP2的蛋白表達(dá)量與UVA模型組相比都有明顯降低，可能是由于PCF抑制了UVA照射后ROS的產(chǎn)生或過氧化物的生成從而減弱了ROS對(duì)UCP2表達(dá)的刺激作用。

UCP2的解偶聯(lián)作用對(duì)細(xì)胞的影響是兩方面的［7］:一方面降低了ROS的產(chǎn)生，起保護(hù)細(xì)胞的作用，如文獻(xiàn)報(bào)道［8］，UCP2高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞因ROS產(chǎn)生增多而引起的凋亡;另一方面也使得細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，使細(xì)胞無法獲得足夠的ATP以抵御傷害性刺激。哪一方面起主要作用會(huì)根據(jù)細(xì)胞的種類和所受刺激的不同而不同，在某些情況下后者對(duì)細(xì)胞的影響可能更為明顯［9］。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)應(yīng)用PCF后UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是降低的，說明PCF并未因其減弱UCP2的表達(dá)而增加細(xì)胞凋亡，也說明UVA照射后UCP2的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響可能第二方面是主要的，這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS來源的一個(gè)主要途徑，也是ROS攻擊的主要目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn) UVA損傷HaCaT細(xì)胞引起線粒體膜電位明顯下降，而PCF則劑量依賴性升高線粒體膜電位。同時(shí)，PCF對(duì)UVA照射引起的細(xì)胞色素C的釋放及Apaf-1的蛋白表達(dá)也起到了有效的抑制作用。課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了PCF對(duì)UVA誘導(dǎo)的caspase-3活化的抑制作用［10］，綜合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明，PCF能夠抑制UVA照射后ROS的產(chǎn)生，從而保護(hù)線粒體膜，抑制線粒體Cyt C/Apaf-1/caspase-3凋亡通路。

線粒體內(nèi)發(fā)生的主要代謝是氧化磷酸化，它是位于線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈功能的主要表現(xiàn)，也是細(xì)胞內(nèi)ROS來源的一個(gè)主要途徑。呼吸鏈中復(fù)合酶Ⅰ(NADH-輔酶Q還原酶)和復(fù)合酶Ⅲ(輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶)是產(chǎn)生超氧陰離子的主要部位，復(fù)合酶Ⅰ是呼吸鏈中最大的、也是第一個(gè)復(fù)合體，早有研究證實(shí)線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I的抑制劑可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11－12］。本實(shí)驗(yàn)通過紫外分光光度法檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I的活性，進(jìn)一步探討UVA輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞線粒體功能的影響及PCF是否具有調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，UVA模型組呼吸鏈復(fù)合酶I的活性明顯下降，而預(yù)先加入PCF孵育的細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合酶I活性的下降被抑制，說明PCF也可以通過提高呼吸鏈復(fù)合酶I的活性，減少ROS的生成，從而抑制UVA引起的細(xì)胞損傷。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，PCF可以增強(qiáng)UVA照射后線粒體呼吸鏈復(fù)合酶的活性，抑制ROS的產(chǎn)生，減弱ROS對(duì)線粒體的損傷，抑制線粒體CytC/Apaf-1/caspase-3凋亡通路，最終達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用。雖然PCF也可抑制UVA照射引起的UCP2表達(dá)增加，減弱細(xì)胞的自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但對(duì)細(xì)胞活性沒有產(chǎn)生明顯的影響。

［1］ Mehta S L，Li P A.Neuroprotective role of mitochondrial uncoupling protein 2 in cerebral stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(6):1069－78.

［2］ Cannon B，Shabalina I G，Kramarova T V，et al.Uncoupling proteins:a role in protection against reactive oxygen species--or not［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1757(5-6):449 －58.

［3］ Svobodova A，Zdarilova A，Maliskova J，et al.Attenuation of UVA-induced damage to human keratinocytes by silymarin［J］.J Dermatol Sci，2007，46(1):21－30.

［4］ Echtay K S，Roussel D，St-Pierre J，et al.Superoxide activates mitochondrial uncouplingproteins［J］. Nature，2002，415(6867):96－9.

［5］ 竇 梅，初 曉，張 杰，等.扇貝多肽保護(hù)單次UVA氧化損傷HaCaT細(xì)胞［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(4):416－20.

［5］ Dou M，Chu X，Zhang J，et al.Polypeptide from chlamys farreri protect HaCaT cells from single UVA induced oxidative damages［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(4):416 －20.

［6］ 王貞麗，李金蓮，王春波.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體及扇貝多肽在UVA誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(10):1375－9.

［6］ Wang Z L，Li J L，Wang C B.The role of tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand and polypeptide from Chlamys farreri in UVA-induced apoptosis in HaCaT cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1375 －9.

［7］ Bodyak N，Rigor D L，Chen Y S，et al.Uncoupling protein 2 modulates cell viability in adult rat cardiomyocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(1):H829 －35.

［8］ Collins P，Jones C，Choudhury S，et al.Increased expression of uncoupling protein 2 in HepG2 cells attenuates oxidative damage and apoptosis［J］.Liver Int，2005，25(4):880 － 7.

［9］ 萬赤丹，王宏博，馮賢松，等.解偶聯(lián)蛋白2過度表達(dá)對(duì)L02肝細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，37(4):469－72.

［9］ Wan C D，Wang H B，F(xiàn)eng X S，et al.Effect of UCP-2 over-expression on ischemia-reperfusion-induced injury of human hepatocyte strain L02［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2008，37(4):469－72.

［10］ Li J L，Liu N，Chen X H，et al.Inhibition of UVA-induced apoptotic signaling pathway by polypeptide from Chlamys farreri in human HaCaT keratinocytes［J］.Radiat Environ Biophys，2007，46(3):263－8.

［11］ Wolvetang E J，Johnson K L，Krauer K，et al.Mitochondrial respiratory chain inhibitors induce apoptosis［J］.FEBS Lett，1994，339(1-2):40－4.

［12］ Higuchi M，Proske R J，Yeh E T.Inhibition of mitochondrial respiratory chain complex I by TNF results in cytochrome C release，membrane permeability transition，and apoptosis［J］.Oncogene，1998，17(19):2515－24.