張海鳳，董亞琳，張 琰

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710038; 2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

沒食子酸(gallic acid)又名五倍子酸，化學(xué)名為3，4，5－三羥基苯甲酸，是自然界分布很廣的一種有機(jī)酸，主要存在于茶葉、五倍子、塔拉、沒食子等植物中，具有抗腫瘤、抗HBsAg/HBeAg和殺錐蟲等作用[1]。其單體或低聚體可用來防治獲得性免疫缺乏綜合征，其甲基化衍生物是合成抗菌、抗心血管疾病、抗癌、鎮(zhèn)靜等藥物的中間體。筆者的前期研究表明，中藥五倍子的水提物具有α－葡萄糖苷酶抑制作用[2]，五倍子的主要水溶性成分之一為沒食子酸。本研究旨在以麥芽糖為底物，采用兩種模型研究沒食子酸的α－葡萄糖苷酶抑制作用及其抑制類型，并利用Caco－2細(xì)胞模型研究其對葡萄糖吸收的抑制作用，初步探討沒食子酸的降血糖機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

CO2培養(yǎng)箱(日本YAMATO);醫(yī)用超凈工作臺(蘇州醫(yī)療器械儀器廠);Bio－RAD Model 550型全自動酶標(biāo)儀(日本);倒置顯微鏡(日本 Olympuse);Waters－510型高效液相色譜儀(德國 Waters)。阿卡波糖(杭州中美華東制藥有限公司，批號為060401);沒食子酸(中國藥品生物制品檢定所，批號為0831－200302)，分別用磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)配制成10 mg/L的儲備液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌待用;血糖試劑盒(上海科華東菱診斷用品有限公司，批號為20071121);麥芽糖(分析純，汕頭市光華化學(xué)廠，批號為051210)，用磷酸鹽緩沖液溶解，過濾除菌，濃度為28 mmol/L;α－葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20，東京 TLC 公司，批號為 MGI01)，用磷酸鹽緩沖液溶解，過濾除菌，濃度為10 g/L。細(xì)胞Caco－2細(xì)胞來源于中科院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(蘭州民海生物制品公司);0.25%胰蛋白酶 (Sigma);5 g/L MTT溶液(Sigma);96孔培養(yǎng)板 (costar)。

1.2 方法

1.2.1 對酶－抑制劑模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用[3]

設(shè)空白組、陰性對照組、陽性對照組和試驗(yàn)組，反應(yīng)于96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行。空白組每孔加入磷酸鹽緩沖溶液200 μL;陰性對照組先加入磷酸鹽緩沖溶液和α－葡萄糖苷酶溶液各40 μL，37℃反應(yīng)10 min后加入120 μL麥芽糖作為底物，37℃反應(yīng)15 min;陽性對照組先加阿卡波糖溶液和α－葡萄糖苷酶溶液各40 μL，阿卡波糖終濃度為250μg/mL，其余步驟同陰性對照組;試驗(yàn)組先加入不同濃度沒食子酸溶液和α－葡萄糖苷酶溶液各40 μL，使沒食子酸的終濃度分別為250，500，1000μg/mL，其余步驟同陰性對照組。反應(yīng)結(jié)束后各組均加入1 mol/L Tris－HCl 50 μL終止反應(yīng)，取50 μL反應(yīng)液，分別加入200 μL的血糖試劑工作液中，37℃反應(yīng)30 min后在490 nm波長處測定吸光度(A值)并記錄，計算抑制率及半數(shù)抑制量(IC50)。

1.2.2 抑制類型確定[4]

在質(zhì)量濃度分別為0，125，250μg/mL的沒食子酸溶液中，分別加入質(zhì)量濃度為 3.5，7.0，14.0，28.0 mmol/L 的麥芽糖，測定酶活力，按照Lineweaver－Burk作圖確定沒食子酸抑制類型。

1.2.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)[5]

采用MTT法測定沒食子酸對Caco－2細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度。將Caco－2細(xì)胞接種于96孔板中，每孔180 μL，密度為4×104/mL，培養(yǎng)24 h后，分別加入沒食子酸溶液20 μL，使沒食子酸終濃度分別為 100，200，250，500，750，1000μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入無血清培養(yǎng)基200 μL及MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔內(nèi)加入150 μL二甲基亞砜，振動10～15 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔吸光度(A值)，記錄結(jié)果。

1.2.4 對Caco－2細(xì)胞模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用[6－7]

設(shè)空白組、陰性對照組、陽性對照組和試驗(yàn)組。Caco－2細(xì)胞接種于24孔板上(4×104個/孔)，4 d后融合，繼續(xù)培養(yǎng)至12 d。試驗(yàn)前移去培養(yǎng)液，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖溶液洗3次，除去細(xì)胞表面的附著物?？瞻捉M每孔加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液;陰性對照組每孔加入800 μL底物和200 μL磷酸鹽緩沖溶液;陽性對照組每孔加入800 μL底物和200 μL阿卡波糖溶液，使其終濃度為250μg/mL;試驗(yàn)組每孔加入800 μL底物和200 μL沒食子酸溶液，使沒食子酸終濃度為 250，500，1000μg/mL。置 37℃反應(yīng) 40 min后移入冰浴，迅速吸出反應(yīng)液50 μL，分別加入200 μL的血糖試劑工作液中，37℃反應(yīng)30 min，在490 nm波長處測定吸光度(A值)并記錄，計算抑制率及 IC50。

1.2.5 對Caco－2單層細(xì)胞模型上葡萄糖吸收的影響

試驗(yàn)在T5培養(yǎng)瓶中的單層細(xì)胞上進(jìn)行。試驗(yàn)前移去培養(yǎng)液，細(xì)胞用空白磷酸鹽緩沖溶液洗3次，除去細(xì)胞表面的附著物。加入含藥磷酸鹽緩沖溶液0.4 mL，37℃孵育10 min后加入0.55 mmol/L的葡萄糖溶液1.6mL，使五倍子終濃度分別為250，500，1000μg/mL;陽性藥組給200μg/mL根皮苷。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，迅速吸出溶液，冰冷(4℃)磷酸鹽緩沖溶液洗細(xì)胞3次，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎，一部分用高效液相色譜法測定細(xì)胞中葡萄糖含量[8－9]，另一部分用于測定細(xì)胞蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 對微量篩選模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用

沒食子酸在以麥芽糖為底物時對α－葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，質(zhì)量濃度為 0，250，500，1000μg/mL 的沒食子酸抑制率分別為 0，(20.53±19.10)% ，(48.78% ±4.84)% ，(61.79±8.23)% ，沒食子酸的 IC50為 577.5μg/mL。250μg/mL 的阿卡波糖抑制率為(80.45±1.18)%。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的沒食子酸抑制α－葡萄糖苷酶的作用均弱于阿卡波糖。結(jié)果見圖1。

圖1 沒食子酸的α－葡萄糖苷酶抑制作用

2.2 抑制類型確定

由Lineweaver－Burk雙倒數(shù)曲線可推測，沒食子酸對α－糖苷酶抑制的抑制類型為競爭性抑制，并可求得α－葡萄糖苷酶的米氏常數(shù) Km=3.51 ×10－4mol/L。結(jié)果見圖 2。

圖2 沒食子酸的雙倒數(shù)酶動力學(xué)曲線

2.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

質(zhì)量濃度為 0，100，200，250，00，750，1000μg/mL 的沒食子酸測得吸光度(A 值)分別為 0.607 ±0.095，0.594 ±0.064，0.561 ±0.048，0.547 ±0.029，0.524 ±0.044，0.523 ±0.056，0.578 ±0.030，試驗(yàn)組與空白組比較無顯著性差異(P＞0.05)?？梢?，試驗(yàn)濃度下的沒食子酸對細(xì)胞無明顯的毒性。

2.4 對Caco－2細(xì)胞模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用

沒食子酸在以麥芽糖為底物時，對Caco－2細(xì)胞所表達(dá)的α－葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，質(zhì)量濃度為0，250，500，1000μg/mL的沒食子酸抑制率分別為 0，(57.43±0.43)% ，(56.23 ±4.32)% ，(98.24±0.31)%;250μg/mL 的阿卡波糖對 Caco－2細(xì)胞的 α －葡萄糖苷酶抑制率達(dá)(84.08±0.44)%。結(jié)果見圖3。

圖3 沒食子酸對Caco－2細(xì)胞的α－糖苷酶抑制作用

2.5 對Caco－2單層細(xì)胞模型上葡萄糖吸收的影響

以葡萄糖為糖源時，陽性藥根皮苷通過抑制葡萄糖載體功能可顯著降低葡萄糖的吸收，阿卡波糖也有此作用，試驗(yàn)條件下不同質(zhì)量濃度沒食子酸也有此作用，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見圖4。

圖4 沒食子酸對Caco－2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

3 討論

Caco－2細(xì)胞是來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞克隆株，體外培養(yǎng)達(dá)到融合后，可自然分化為與成熟小腸細(xì)胞具有相似形態(tài)和生化特性的細(xì)胞。它具有細(xì)胞極性并緊密連接，在腸腔側(cè)分化出的絨毛膜面含有典型的小腸微絨毛水解酶(麥芽糖酶、蔗糖酶、6－α－葡萄糖苷酶、乳糖酶、氨基肽酶N和蛋白酶C)和各種營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體，如P－糖蛋白(P－gp)、二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體等[10]。由于Caco－2細(xì)胞具有與人小腸上皮細(xì)胞相似的糖消化、吸收和葡萄糖異生相關(guān)酶，故可利用其表達(dá)的α－葡萄糖苷酶構(gòu)建模型，研究五倍子水溶性成分沒食子酸對α－糖苷酶的作用。試驗(yàn)中選擇蔗糖和麥芽糖兩種底物，但以蔗糖為底物時，生成的游離葡萄糖量很少，幾乎無法用氧化酶法檢測，故未得到有意義的結(jié)果，因此未采用蔗糖作底物。

中藥五倍子在治療糖尿病方面有著悠久的歷史，筆者的前期研究表明，其水提物能很好地抑制α－葡萄糖苷酶活性[2]。五倍子水溶性成分之一為沒食子酸，以4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物，沒食子酸具有抑制α－D－葡萄糖苷酶活性的作用[6]。筆者以麥芽糖為底物進(jìn)行試驗(yàn)也獲得了類似的結(jié)果。研究中還發(fā)現(xiàn)，沒食子酸除可抑制α－葡萄糖苷酶活性外，還可抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，從而減少葡萄糖的攝取、吸收，通過多個途徑發(fā)揮降糖作用，但其降糖作用和效果還有待于動物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

在酶－抑制劑模型和Caco－2細(xì)胞模型中，同一質(zhì)量濃度沒食子酸的α－葡萄糖苷酶抑制率以及沒食子酸的 IC50并不一致，可能與Caco－2細(xì)胞模型上表達(dá)的α－葡萄糖苷酶量有關(guān)，故要構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的α－葡萄糖苷酶靶向Caco－2細(xì)胞模型篩選α－葡萄糖苷酶抑制劑，仍需要進(jìn)一步探討;也可能是沒食子酸對α－葡萄糖苷酶源具有選擇性。從酶源選擇性的角度來看，Caco－2細(xì)胞模型表達(dá)的α－葡萄糖苷酶具有人源性，該模型上得到的結(jié)果可能更真實(shí)、可靠。

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