陳淑燕,周文富

(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程系,福建 三明 365004)

柿葉為柿樹科(Ebenaceae)的新鮮或干燥葉。我國是世界上主要的柿子生產(chǎn)國，南北各地普遍栽培、分布廣泛。柿葉的有效成分主要是黃酮類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)的有黃芪苷、山萘酚、山萘酚3-O-β-D-葡萄糖苷、山萘酚3-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚3-β-D-木糖苷、山萘酚3-O-α-L-阿拉伯糖苷、槲皮素、3-O-[ 2″-O-(3，4，5-三羥基苯甲基酰)]-葡萄糖苷、異槲皮素、蘆丁、金絲桃苷(槲皮素-3-半乳糖苷)、楊梅樹皮苷等[1～4]。柿葉中的黃酮具有抗氧化、清除自由基、抗過敏、保護(hù)肝臟、抗菌消炎、生津止渴、改善心腦血管循環(huán)、降低膽固醇、解痙孿、抗癌防癌等功能，在防治中老年人腦動(dòng)脈硬化、預(yù)防腦血栓、防治老年癡呆和其它神經(jīng)性疾病、皮膚抗衰老、美容等方面有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[1～4]。因此，柿葉中黃酮類化合物的藥用開發(fā)是近年研究的熱點(diǎn)之一[4～20]。

目前，黃酮類化合物的提取方法主要有冷浸法、煎煮法、回流提取法、稀醇提取法、水提取法、傳統(tǒng)乙醇提取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法和微波法[11～18]。其中微波法具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、提取率高、能耗低、不產(chǎn)生噪音等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于熱不穩(wěn)定生物質(zhì)藥物的提取[9，12，15]。

作者在此以三明地區(qū)柿葉為原料，采用微波法提取柿葉中總黃酮，并優(yōu)化了提取工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

柿葉(七月下旬)采自福建三明三元地區(qū)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；95%乙醇、石油醚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉，均為分析純；超純水。

NJL07-3 型實(shí)驗(yàn)專用微波爐，南京杰全微波設(shè)備有限公司；360FTIR型傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet 公司；UV-1100 型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海基瑋實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；722S 型可見分光光度計(jì)、FA1604N 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB23型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博經(jīng)經(jīng)貿(mào)公司。

1.2 方法

1.2.1 柿葉總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取1.00 g 柿葉粉末(過120 目篩)于三角錐形瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的乙醇溶液，搖勻，將瓶口用保鮮膜覆蓋，浸泡1 h后，在一定的微波功率下輻射提取一定時(shí)間，趁熱抽濾，將濾液移至梨形分液漏斗中加石油醚純化脫除雜質(zhì)。移至100 mL容量瓶定容后搖勻，作為供試品溶液備用。

1.2.2 柿葉總黃酮的測定[11，12，15]

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于120 ℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取10.0 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加60%(質(zhì)量濃度，下同)乙醇溶解，定容至50 mL，得濃度為0.200 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 最大吸收波長的選擇

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、供試品溶液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入4% NaOH溶液10 mL，搖勻，用60%乙醇定容，搖勻。不加供試品溶液、不加標(biāo)準(zhǔn)溶液、只加顯色劑同法制得空白對照液。將溶液靜置15 min后用紫外可見分光光度計(jì)于波長400～600 nm范圍進(jìn)行掃描。測試結(jié)果表明供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液均在波長510 nm處有最大吸收峰。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶中，按1.2.2.2方法于510 nm 處測定吸光度，以蘆丁濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度(y) 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。擬合線性回歸方程為：y=0.0115x-0.0005，R2=0.9999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2.4 樣品含量的測定

精密吸取供試品溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，按1.2.2.2方法測定吸光度?？傸S酮的提取率依下式計(jì)算：

式中：mi為樣品中總黃酮的含量(以蘆丁計(jì))，%；c為樣品中黃酮的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；W為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 柿葉提取物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 紫外光譜分析(圖2)

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)與柿葉提取物(b)的紫外吸收光譜

由圖2可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在240～290 nm 和300～400 nm 兩波帶各有一個(gè)吸收峰，柿葉提取物兩吸收峰與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品相似，證實(shí)柿葉提取物的骨架和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)與蘆丁相似，是黃酮類化合物。

2.1.2 紅外光譜分析(圖3)

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和柿葉提取物(b)的紅外光譜

由圖3可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在3422.72 cm-1處為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，峰形寬大、強(qiáng)度較大，說明有酚羥基或締合的羥基存在;2926.76 cm- 1處為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，強(qiáng)度較小，說明飽和碳上的氫較少；1663.56 cm- 1處為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰；1596.00 cm- 1、1446.55 cm-1處為苯環(huán)C-C骨架伸縮振動(dòng)吸收峰，說明有苯環(huán)存在；1200 cm- 1左右為C-O伸縮振動(dòng)吸收峰。柿葉提取物特征峰與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品基本相似，表明從柿葉中提取的成分與蘆丁相似，進(jìn)一步證實(shí)其確是黃酮類化合物。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇質(zhì)量濃度對柿葉總黃酮提取率的影響

固定固液比(g∶mL,下同)為1∶25、微波輻射功率為300 W，微波輻射間歇提取3次，每次3 min，考察乙醇質(zhì)量濃度對柿葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇質(zhì)量濃度對柿葉總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著乙醇質(zhì)量濃度的增大，柿葉總黃酮提取率逐漸上升；當(dāng)乙醇質(zhì)量濃度為65%時(shí)，柿葉總黃酮提取率最高；但乙醇質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，柿葉總黃酮提取率反而降低。這可能與黃酮類化合物的極性相關(guān)，不同質(zhì)量濃度的乙醇極性不同，增大乙醇質(zhì)量濃度可以增強(qiáng)溶劑對柿葉粉末的滲透性，加大黃酮類化合物的溶解度。根據(jù)相似相溶原理，乙醇質(zhì)量濃度為65%時(shí)柿葉總黃酮的提取率最高。乙醇質(zhì)量濃度高于65%時(shí)，其對色素的溶解性提高，提取液中帶入色素的量增加。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未去除的色素(如葉黃素、葉綠素、胡蘿卜素等)的基團(tuán)可與顯色劑顯色，增大吸光度，導(dǎo)致提取率假性提高，因此粗產(chǎn)品的純化、脂溶性物質(zhì)去除等十分關(guān)鍵。

2.2.2 微波輻射時(shí)間對柿葉總黃酮提取率的影響

固定固液比為1∶25、乙醇質(zhì)量濃度為65%、微波輻射功率為300 W，考察微波輻射時(shí)間(每次輻射3 min，輻射不同次數(shù))對柿葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 微波輻射時(shí)間對柿葉總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著微波輻射時(shí)間的延長,柿葉總黃酮提取率不斷上升；但輻射超過15 min后柿葉總黃酮提取率有所下降。這可能是因?yàn)椋虝r(shí)間的微波輻射對柿葉細(xì)胞膜的破碎率較大、浸出的總黃酮較多，提取率上升到一定的程度后就趨于平衡。

2.2.3 固液比對柿葉總黃酮提取率的影響

固定微波輻射功率為300 W、乙醇質(zhì)量濃度為65%，微波輻射間歇提取3 次，每次3 min，考察固液比對柿葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 固液比對柿葉總黃酮提取率的影響

由圖6可知，隨著固液比的減小(即溶劑量的增大)，柿葉總黃酮的提取率不斷提高；但固液比減小到1∶25 時(shí)，繼續(xù)增加溶劑的量對柿葉總黃酮提取率影響不大。這可能是因?yàn)?，溶劑量較小時(shí)，柿葉中的總黃酮沒有完全溶解于溶劑中，因此提取率低；隨著溶劑量的增加，柿葉總黃酮不斷被溶解，提取率逐漸增大；但溶解至飽和、趨于平穩(wěn)后再增加溶劑量就造成浪費(fèi)。

2.2.4 微波輻射功率對柿葉總黃酮提取率的影響

固定固液比為1∶25、乙醇質(zhì)量濃度為65%，微波輻射間歇提取3 次，每次3 min，考察微波輻射功率對柿葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 微波輻射功率對柿葉總黃酮提取率的影響

由圖7可知，柿葉總黃酮提取率隨著微波輻射功率的增大先上升后下降，微波輻射功率為300 W時(shí)柿葉總黃酮的提取率最高。這可能是因?yàn)?，微波輻射功率低時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)不劇烈、對細(xì)胞破壞程度小，提取率低；隨著微波輻射功率增大，分子運(yùn)動(dòng)加劇，對細(xì)胞破壞程度加大，滲透、溶解、擴(kuò)散加強(qiáng)，浸出的總黃酮就越多；當(dāng)微波輻射功率超過300 W后，大功率微波輻射產(chǎn)生的強(qiáng)熱效應(yīng)破壞了提取液中黃酮的結(jié)構(gòu)并使蛋白質(zhì)凝固、黃酮不易溶出，同時(shí)對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)選擇性差異減小，易溶于溶劑的雜質(zhì)先被溶出從而影響了提取率，且微波輻射功率過大易發(fā)生暴沸，不利于提取操作。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)[16]

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇質(zhì)量濃度、微波輻射功率、固液比和微波輻射時(shí)間作為考察因素，采用L9(34) 正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表1可知，各因素對微波法提取柿葉總黃酮提取率的影響大小依次為：乙醇質(zhì)量濃度>微波輻射時(shí)間>微波輻射功率>固液比。確定最佳提取工藝條件為：A2B3C2D3，即乙醇質(zhì)量濃度為65%，微波輻射時(shí)間為15 min(間歇輻射5次，每次3 min)，固液比為1∶25，微波功率為300 W。該條件下柿葉總黃酮提取率為5.22%。

2.4 不同提取方法的比較(表2)

表2 不同提取方法的比較

由表2可知，微波法提取柿葉總黃酮與其它提取法相比，提取率最高，為5.22%，而超聲波法和乙醇浸提法分別為4.54%和3.72%。微波提取法高效、省時(shí)、節(jié)能、提取率高，與超聲波法和乙醇浸提法相比具有一定的優(yōu)勢。

3 結(jié)論

(1)微波法提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇質(zhì)量濃度65%，固液比1∶25(g∶mL)，微波輻射功率300 W，間歇輻射5次，每次3 min。該條件下柿葉總黃酮的提取率達(dá)5.22%。

(2)微波法提取柿葉總黃酮，高效、省時(shí)、節(jié)能、提取率高，與超聲法和乙醇浸提法相比具有一定的優(yōu)勢。

(3)由于未去除的色素(如葉黃素、葉綠素、胡蘿卜素等)的基團(tuán)可與顯色劑顯色，增大吸光度，導(dǎo)致提取率假性提高，因此粗產(chǎn)品的純化、脂溶性物質(zhì)去除等十分關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭皓，魯周民，劉月梅,等.柿葉的藥理作用研究進(jìn)展及開發(fā)利用現(xiàn)狀[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，35(12):81-86.

[2] 林嬌芬，林河通，謝聯(lián)輝，等.柿葉的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用及開發(fā)利用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(7):90-96.

[3] 辛寧，豐杰，姚波.柿葉黃酮類提取分離及藥理作用研究概況[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35(2):49-51.

[4] 張琳，陸維敏.黃酮類化合物抗氧化性能與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，33(2)：187-191.

[5] 王樹松，劉風(fēng)云.不同生長期柿葉總黃酮和槲皮素的含量測定[J].藥物鑒定，2007，16(9):22-23.

[6] 吳玉林，林嬌芬，林河通，等.采收期對安溪油柿柿葉化學(xué)成分含量的影響[J].包裝與食品機(jī)械，2007，25(6):19-22.

[7] 原江鋒，楊建雄，張志琪，等.產(chǎn)地和季節(jié)對柿葉中總黃酮、蘆丁和齊墩果酸含量的影響[J].中成藥，2006，28(12):1757-1759.

[8] 岳紅，趙曉莉，張穎.超臨界二氧化碳萃取柿葉黃酮的工藝研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2005，17(3):4228-4231.

[9] 張益娜，謝瓊，李敏，等.新疆沙棘葉總黃酮的微波輔助提取和鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，44(6):761-764.

[10] 衛(wèi)靜莉，高松平，董梅.柿葉提取黃酮類化合物方法及鑒定[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21(3):47-49.

[11] 林燕鈴，周文富.微波提取蘋果渣中總黃酮的工藝研究[J].應(yīng)用化工，2011，40(2):311-314.

[12] 余其鳳，周文富.建寧產(chǎn)蓮子心總黃酮的微波輔助提取研究[J].化學(xué)與生物工程，2011，28(2):32-37.

[13] 張巖，曹國杰，張燕，等.黃酮類化合物的提取以及檢測方法的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2008，29(1):154-158.

[14] 鐘方麗，王曉林，安媛.返魂草中總黃酮提取工藝研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(22):1937-1939.

[15] 劉仙金，周文富.草珊瑚總黃酮的微波提取[J].化學(xué)與生物工程，2010，27(1):42-46.

[16] Li Y，Zhang D M，Yu S S，et al.A novel phenylpropanoid-substituted catechin glycoside and a new dihydrochalcone fromSarcandraglabra[J].Chin Chem Let，2006，17(2):207-210.

[17] 沈彤，賈忠建，鄭尚珍.逆阿落中的黃酮化合物[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(1):4-6.

[18] Akagi Takashi，Ikegami Ayako，Suzuki Yasuhiko，et al.Expression balances of structural genes in shikimate and flavonoid biosynthesis cause a difference in proanthocyanidin accumulation in persimmon(DiospyroskakiThunb.) fruit[J].Springer-Verlag，2009，230(5):899-915.

[19] Zgórka G，Hajnos A.The application of solid-phase extraction and reversed phase high-performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of plant flavonoids and phenolic acids[J].Chromatographia Supplement，2003,57(Supp1):77-80.

[20] Ikegami Ayako，Akagi Takashi，Potter Daniel，et al.Molecular identification of 1-Cys peroxiredoxin and anthocyanidin/flavonol 3-O-galactosyltransferase from proanthocyanidin-rich young fruits of persimmon(DiospyroskakiThunb.)[J].Planta，2009，230(4):841-855.