劉立堅(jiān)，冷 艷，李雨亭，謝衛(wèi)紅

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071)

有機(jī)磷農(nóng)藥是世界上使用范圍最廣、用量最大的農(nóng)藥品種。我國作為高毒農(nóng)藥生產(chǎn)大國，其中有機(jī)磷農(nóng)藥的產(chǎn)量大約占整個農(nóng)藥工業(yè)的57%[1]，有關(guān)有機(jī)磷農(nóng)藥的急性中毒事件時有發(fā)生[2]。甲基對硫磷雖屬慎用或禁用有機(jī)磷農(nóng)藥之列[3]，但由于其廉價高效，至今仍被違規(guī)使用，其殘毒造成了食品和環(huán)境的嚴(yán)重污染，檢測及監(jiān)控其使用情況是亟待解決的問題。

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室欲采用分子印跡技術(shù)[4]制備甲基對硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase，MPH，E.C 3.1.8.1)的均質(zhì)印跡膜。研制過程中制備的印跡模板可利用MPH催化甲基對硫磷生成黃色對硝基苯酚的反應(yīng)[5]對農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。以此模板制備的分子印跡膜可作為生物檢測器件的雛形，其檢測信號的準(zhǔn)確性與重復(fù)性關(guān)鍵在于膜的均質(zhì)性，而膜的均質(zhì)性則很大程度上取決于印跡模板的均質(zhì)性。作者在此設(shè)計(jì)在甲基對硫磷水解酶的C端連上一段末端為半胱氨酸的錨鏈，使其能定向地固定于經(jīng)硅烷化修飾的基底表面，以此制備均質(zhì)性良好的印跡模板。因此，甲基對硫磷水解酶的重組表達(dá)及純化是其中重要一環(huán)。作者在此進(jìn)行了帶錨鏈的甲基對硫磷水解酶的基因構(gòu)建及表達(dá)純化研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑

E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、pET5a-mph、pET28a(+)均由武漢病毒研究所惠贈；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NdeⅠ和XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶，Takara公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Omega Bio-Tek公司；PCR引物及Linker由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Ni Sepharose，GE Healthcare公司；甲基對硫磷(純度為99%)，自行合成；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，Beyotime公司；其它試劑均為分析純。

1.2 mph基因的PCR擴(kuò)增

以質(zhì)粒pET5a-mph為模板，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增兩端分別帶有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的mph基因編碼序列，合成的上游引物為5′-ACTCTCATATGGCCGCACCGCA-3′，下游引物為5′-TCCGGAATTCCTTGGGGTTGAC-3′。在30 μL PCR反應(yīng)體系中含1×Pyrobest DNA聚合酶緩沖溶液3 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 1 μL，pET5a-mph0.5 μL，200 μg·mL-1上、下游引物各0.5 μL，100 μg·mL-1BSA溶液1 μL，Pyrobest DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.3 μL ，ddH2O。PCR條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 重組質(zhì)粒pET28a-mph的構(gòu)建

經(jīng)電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物片段大小后，用試劑盒純化。純化產(chǎn)物用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切，然后將mph酶切片段插入經(jīng)同樣雙酶切的pET28a(+)載體中。連接體系為：10×T4 DNA連接酶緩沖溶液1 μL，載體pET28a(+) 1 μL，目的片段mph2 μL，T4 DNA連接酶0.1 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并用含有50 μg·mL-1Kan的LB平板進(jìn)行篩選，對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒pET28a-mph-lc的構(gòu)建

人工合成帶編碼半胱氨酸-(Gly-Ser)5-Cys的寡聚核苷酸序列(含有克隆所需的EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn))，Linker-c1：5′-AATTCAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGTTGCTAAC-3′，Linker-c2：3′-GTCGCCGAGACCAAGGCCATCGCCAAGGCCAACGATTGAGCT-5′，將此兩條單鏈在94 ℃ 5 min、65 ℃ 15 min條件下退火得到雙鏈Linker-c。與經(jīng)同樣雙酶切且膠回收純化的pET28a-mph在T4 DNA連接酶作用下16 ℃過夜連接，10 μL連接體系如下：10×T4 DNA連接酶緩沖溶液1 μL，pET28a-mph1 μL，Linker-c 2 μL，T4 DNA連接酶0.1 μL，ddH2O。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含有50 μg·mL-1Kan的LB平板進(jìn)行篩選，對篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證。

1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮的LB平板上挑取重組菌菌落，接種于5 mL帶有相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng)，以1%的比例接種到抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600≈0.5～0.6)，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。將菌液倒入離心管中平衡，于高速冷凍離心機(jī)中4 ℃、8000 r·min-1下離心10 min，棄上清收集菌體。用含20 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl緩沖溶液(pH值 8.0)洗滌沉淀2次，并最終將其溶于40 mL相同緩沖溶液中。將重懸液冰水浴置于超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行破碎：功率200 W，每超聲3 s間隔5 s，共200次。4 ℃、10 000 r·min-1下離心30 min，取上清，用0.45 μm濾膜過濾，待上柱純化。

1.6 目的蛋白的純化

由于甲基對硫磷水解酶末端連接有pET28a(+)載體表達(dá)的6個組氨酸(His)，故可以采用Ni-NTA 親和層析柱進(jìn)行純化。取Tris-HCl緩沖溶液(含20 mmol·L-1咪唑、0.5 mol·L-1NaCl，pH值8.0)平衡柱子，流速為1 mL·min-1。將甲基對硫磷水解酶粗酶液上柱，流速為0.6 mL·min-1，His與鎳結(jié)合使帶His標(biāo)記的蛋白質(zhì)吸附在鎳柱上，不帶His標(biāo)記的蛋白質(zhì)穿流下來。分別用含60 mmol·L-1、100 mmol·L-1、150 mmol·L-1咪唑的緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，同時在280 nm處進(jìn)行連續(xù)紫外檢測，根據(jù)監(jiān)測波峰收集蛋白并留樣進(jìn)行SDS-PAGE(12%)電泳，然后于20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH值8.0)中透析以獲得純化蛋白。

1.7 蛋白濃度測定

采用BCA法測定蛋白濃度[6]，以BSA 作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.8 甲基對硫磷水解酶活性分析

底物甲基對硫磷溶液在甲基對硫磷水解酶催化下生成于405 nm處有最大吸收峰的黃色產(chǎn)物對硝基苯酚，造成溶液吸光度的變化，據(jù)此可分析甲基對硫磷水解酶的酶學(xué)活性。配制100 mmol·L-1甲基對硫磷甲醇溶液，將其用20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH值8.0)稀釋至10 mmol·L-1；將融合型蛋白MPH-L及野生型蛋白MPH-W用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至10 μg·mL-1；取190 μL MPH-L、MPH-W及Tris-HCl緩沖溶液分別加到96孔板中，然后同時加入10 μL 10 mmol·L-1的甲基對硫磷溶液，即底物終濃度為0.5 mmol·L-1，反應(yīng)總體積為200 μL，計(jì)時1 min，室溫下于酶標(biāo)儀中測定其在405 nm處吸光度。做多組平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增目的片段mph

以質(zhì)粒pET5a-mph為模板，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

1. PCR product of mph M. DL 5000 DNA marker

由圖1可以看出，泳道1上檢測到一個約890 bp的DNA片段(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，大小與預(yù)期結(jié)果相符，且無其它非特異性的雜帶存在，初步確定該890 bp左右的DNA片段為mph基因。

2.2 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

從菌液中提取重組質(zhì)粒pET28a-mph-lc，利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。

M. DL 5000 DNA marker

由圖2可以看出，經(jīng)NdeⅠ及XhoⅠ雙酶切后，重組質(zhì)粒獲得兩個特異性條帶，大小分別與目的片段及載體相符，表明目的基因已成功構(gòu)建到表達(dá)載體。

2.3 目的蛋白的表達(dá)與純化

經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件，最終獲得目的蛋白最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為：30 ℃下0.4 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。確定的適宜梯度洗脫條件為：100 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(含20 mmol·L-1咪唑、0.5 mol·L-1NaCl，pH值8.0)，洗脫流速為1 mL·min-1。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖3)顯示，含pET28a-mph-lc的重組菌能夠生成分子量約35 ku的融合型蛋白MPH-L，與理論值相符。

M. Low molecular weight marker 1.MPH-L 2.MPH-W

2.4 甲基對硫磷水解酶活性分析(表1)

表1 MPH-L與MPH-W酶學(xué)反應(yīng)后吸光度值比較

由表1可知，溶液狀態(tài)下，MPH-L與底物反應(yīng)吸光度均值為1.1598，MPH-W為1.1114，兩者差別不大，初步證明對MPH-L的基因改造于其酶學(xué)活性幾乎無影響。

3 結(jié)論

用PCR方法獲得甲基對硫磷水解酶編碼基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mph-lc，將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)OD600達(dá)到0.5～0.6時，用終濃度0.4 mmol·L-1的IPTG在30 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)5 h，破碎離心后，利用Ni-NTA親和層析純化得到具有活性的融合蛋白MPH-L，即在甲基對硫磷水解酶的C端連上一段末端為半胱氨酸的錨鏈，使得其能定向地固定于經(jīng)硅烷化修飾的基底表面，為制備生成均質(zhì)分子印跡膜的模板奠定了基礎(chǔ)。

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