趙 軍 沈文文 樊 洪

外傷、炎癥及腫瘤等常會造成口腔頜面部的骨質(zhì)缺損，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，因此骨缺損修復(fù)的研究很有意義。β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）等人工合成的骨替代材料表面常常缺乏細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間信息交流的機(jī)制而影響了細(xì)胞的黏附，并進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖與分化。P-15多肽是Ⅰ型膠原中含有細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的15個氨基酸序列的人工合成肽，參與成骨性細(xì)胞的黏附、增殖與分化等生物學(xué)行為。本研究旨在觀察β-TCP吸附P-15多肽后對細(xì)胞生長的影響，為進(jìn)一步體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 β-TCP購自武漢華威生物材料工程有限公司，氣孔率為40%~70%，氣孔孔徑為10~1000μm，平均380μm，抗壓強(qiáng)度大于1.5×103kPa；P-15多肽凍干粉（GTPGPQGIAGQRGVV）由南京金思特科技有限公司合成，純度大于90%。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司），Cell Counting Kit-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程有限公司），BCATMpro?tein assay kit（Thermo Scientific），RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），TJJ-1300超凈臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），NAPCO細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Fisher公司），48孔培養(yǎng)板（Gibco），酶標(biāo)儀（Thermo Labsysytems）。

1.3 方法

1.3.1 β-TCP/P-15復(fù)合材料的制備 將β-TCP修整成 5.0 mm×5.0mm×1.5mm大小，蒸餾水加壓反復(fù)沖洗，高壓蒸汽消毒備用。將P-15多肽溶解于PBS中，質(zhì)量濃度為100 mg/L[1]，過濾除菌。然后將β-TCP放到P-15溶液中，輕微震蕩以確保P-15充分吸附到β-TCP中，室溫條件下放置24 h，再用PBS沖洗去除未吸附的P-15，干燥后室溫條件下儲存在防潮的容器中。

1.3.2 成肌細(xì)胞的培養(yǎng)與刺激誘導(dǎo) 復(fù)蘇由南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子遺傳實(shí)驗(yàn)室提供并凍存的鼠成肌細(xì)胞系C2C12，待細(xì)胞正常生長后向培養(yǎng)基中分別加入100 μg/L和200 μg/L的骨形成蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）刺激C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。刺激液為含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 d后測定堿性磷酸酶活性的變化。100 μg/L組、200 μg/L組及未刺激組的堿性磷酸酶活性分別為（1.98±0.07）U/g、（4.46±0.05）U/g及（0.53±0.02）U/g，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用200 μg/L的BMP2刺激的C2C12細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞與修復(fù)材料體外培養(yǎng) 將β-TCP/P-15（β-TCP/P-15組）與β-TCP（β-TCP組）分別浸泡在培養(yǎng)液中，24 h后取出，置于48孔板中，分別加入誘導(dǎo)培養(yǎng)的1.2×106/mL的C2C12細(xì)胞懸液10 μL，3~4 h后加培養(yǎng)液至500 μL，置于CO2孵育箱內(nèi)、37℃及5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)6 d。

1.3.4 細(xì)胞增殖情況的測定 β-TCP/P-15組于培養(yǎng)后的2、4及6 d，吸棄剩余培養(yǎng)基后，于培養(yǎng)孔中重新加入180 μL新培養(yǎng)基和18 μL CCK-8試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1~4 h，每孔均取出110 μL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到96孔板中，用酶標(biāo)儀選擇波長450 nm測定其光密度（OD）值，每個時間點(diǎn)測4孔，第1個時間點(diǎn)測定后下2個時間點(diǎn)重新選取含有材料的培養(yǎng)孔進(jìn)行測定。同時以刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)于β-TCP上生長作為對照組，在相同時間點(diǎn)上進(jìn)行檢測。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量和堿性磷酸酶活性的檢測 β-TCP/P-15組分別于培養(yǎng)后的2、4、6 d各取8塊材料，分別用于蛋白質(zhì)含量和堿性磷酸酶活性的檢測，每組每個時點(diǎn)4塊，消化收集細(xì)胞，PBS洗2遍,加入RIPA裂解液50 μL，冰上放置15 min，每5 min震蕩1次，12 000 r/min離心20 min，取上清液。（1）BCA法測定蛋白質(zhì)含量：每個時點(diǎn)取4塊材料，按上述方法操作后，取上清液，測出各孔OD570的大小，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白含量，同時以刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)于β-TCP上生長作為對照組。（2）堿性磷酸酶活性的檢測：β-TCP/P-15組按上述操作，取上清液30 μL，加入標(biāo)本測定管中，按堿性磷酸酶試劑盒說明進(jìn)行檢測。堿性磷酸酶活性=（OD標(biāo)本/OD標(biāo)準(zhǔn)）×酚的含量/蛋白質(zhì)的含量。同時以刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)于β-TCP上生長作為對照組，并比較2組中細(xì)胞在相同時間點(diǎn)的堿性磷酸酶活性的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用2獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組材料對細(xì)胞增殖的影響 β-TCP組與β-TCP/P-15組的細(xì)胞增殖情況隨時間的延長而呈增加趨勢，β-TCP/P-15組較β-TCP組各相同時點(diǎn)細(xì)胞增殖明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 CCK8法測定2組細(xì)胞增殖情況的比較（n=4，OD值±s）

表1 CCK8法測定2組細(xì)胞增殖情況的比較（n=4，OD值±s）

*P<0.05；表2、3同

組別β-TCP β-TCP/P-15 t 2 d 1.141 3±0.083 9 1.391 5±0.060 2 4.844*4 d 1.568 5±0.048 9 1.871 0±0.462 0 8.994*6 d 2.123 8±0.061 6 2.364 8±0.074 6 4.980*

2.2 2組細(xì)胞蛋白含量的比較 2組細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞蛋白含量隨時間的延長而呈增加趨勢，β-TCP/P-15組較β-TCP組各相同時點(diǎn)蛋白含量明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 BCA法測定2組細(xì)胞蛋白含量的比較（n=4，g/L±s）

表2 BCA法測定2組細(xì)胞蛋白含量的比較（n=4，g/L±s）

組別β-TCP β-TCP/P-15 t 2 d 0.620 0±0.042 4 0.820 0±0.077 5 4.529*4 d 1.000 0±0.021 2 1.360 0±0.033 7 15.123*6 d 1.480 0±0.108 0 1.847 5±0.094 3 5.126*

2.3 2組堿性磷酸酶活性的比較 在細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)2 d時2組材料均未檢測出堿性磷酸酶的活性；培養(yǎng)4、6 d后β-TCP/P-15組較β-TCP組各相同時點(diǎn)堿性磷酸酶的活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

堿性磷酸酶是細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志之一，其活性水平代表了成骨細(xì)胞的分化程度，BMP2能夠誘導(dǎo)鼠成肌細(xì)胞系C2C12向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化[2]。本研究結(jié)果顯示，刺激后C2C12堿性磷酸酶的活性明顯高于未刺激的C2C12堿性磷酸酶的活性，表明C2C12已向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

Ⅰ型膠原可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖與分化，這些功能與其分子結(jié)構(gòu)中含有特定的氨基酸序列有關(guān)。Bhatnagar等[3]檢測了Ⅰ型膠原的結(jié)構(gòu)且在a1鏈中證實(shí)了有一段強(qiáng)力的細(xì)胞黏附性區(qū)域，此區(qū)域的序列為GTPGPQGIAGQRGVV（P-15）。然而在膠原分子的多鏈結(jié)構(gòu)中，大部分結(jié)合位點(diǎn)未暴露而影響了細(xì)胞的黏附，采用克隆的方法將Ⅰ型膠原結(jié)合位點(diǎn)上這15個特殊氨基酸序列復(fù)制合成出來，得到的則是一種生物仿生材料[1]。P-15修飾材料后，可提高材料的生物活性，促進(jìn)細(xì)胞的黏附與增殖，并且可促進(jìn)細(xì)胞的分化能力。Emecen等[4]研究發(fā)現(xiàn)P-15與羥基磷灰石復(fù)合后能促進(jìn)牙周膜纖維細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞生長因子mRNA的表達(dá)。周炳榮等[5]合成了一種更短的多肽，含有6個氨基酸序列（P-6），其來源于P-15肽，并單獨(dú)用含有不同濃度P-6的培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果表明P-6能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Neiva等[6]在臨床試驗(yàn)中也證實(shí)了P-15是一種很好的仿生材料。

β-TCP為人工骨材料，比羥基磷灰石具有更好的骨傳導(dǎo)性和生物降解性[7]，但其骨誘導(dǎo)能力較弱，形成的骨量很少[8]；并且材料表面親水性較差，對細(xì)胞的吸附力較弱，材料內(nèi)部不能獲得足夠的細(xì)胞濃度，需要在其表面復(fù)合細(xì)胞膜受體所能識別的特異性蛋白質(zhì)，以促進(jìn)細(xì)胞與材料的結(jié)合。本研究將P-15復(fù)合到β-TCP表面，選用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，相對于傳統(tǒng)的MTT法，其線性范圍更寬，靈敏度更高，且結(jié)果顯示P-15修飾后的材料在各個時間點(diǎn)均促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，表明β-TCP吸附P-15后，其表面性能得到改善，細(xì)胞易與材料結(jié)合，細(xì)胞復(fù)合后蛋白含量的測定結(jié)果與CCK8結(jié)果較一致，β-TCP經(jīng)P-15修飾后細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量升高。另外，4、6 d時β-TCP/P-15組的堿性磷酸酶活性均高于β-TCP組，表明材料復(fù)合P-15后促進(jìn)了細(xì)胞的分化，但在2個時點(diǎn)細(xì)胞堿性磷酸酶的活性均低于剛誘導(dǎo)完的C2C12的活性，考慮可能是誘導(dǎo)后的C2C12細(xì)胞還不穩(wěn)定所致。

綜上，β-TCP吸附P-15后的生物相容性得到了一定的提高，但改變P-15的濃度對生物相容性是否有一定的影響尚有待于進(jìn)一步的研究。

表3 2組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性 （n=4，U/g±s）

表3 2組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性 （n=4，U/g±s）

組別β-TCP β-TCP/P-15 t 4 d 1.12±0.05 1.36±0.02 7.466*6 d 1.58±0.03 2.32±0.05 27.969*

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