孔繁強(qiáng) 周樹民 趙榮蘭 孫 蓓 梁東春

機(jī)體在遭受感染、創(chuàng)傷等應(yīng)激作用時(shí)會(huì)出現(xiàn)糖代謝改變，若糖的生成率超過(guò)清除率則會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激性高血糖。持續(xù)的高血糖可導(dǎo)致高滲血癥、代謝性酸中毒和組織細(xì)胞損傷。應(yīng)激期間血糖控制的好壞是評(píng)價(jià)糖尿病預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)[1]。對(duì)于應(yīng)激性高血糖，臨床上常采用強(qiáng)化胰島素治療的方案，效果較好[2]。但對(duì)于伴有胰島素抵抗（insulin resis?tance，IR）的糖尿病患者，強(qiáng)化胰島素治療卻收效甚微。研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）-1對(duì)糖尿病特別是IR糖尿病患者具有較好的治療作用[3]。本文旨在研究重組人IGF（rhIGF）-1對(duì)2型糖尿?。═2DM）伴IR小鼠應(yīng)激性血糖升高的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 瘦素受體基因缺陷的db/db小鼠（n=30）及同品系的正常小鼠（n=15）均購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物中心；rhIGF-1為本實(shí)驗(yàn)室自行制備[4]；SYBR green Real-time PCR試劑盒和TaqDNA聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品；兔抗小鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶（GLUT）4多克隆抗體及HRP標(biāo)記的上樣抗兔IgG購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；小鼠胰島素測(cè)定試劑盒購(gòu)自瑞典Mercodia公司；小鼠IGF-1測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Antigenix公司。

1.2 方法

1.2.1 db/db小鼠血糖及血胰島素水平的監(jiān)測(cè) 自6周齡后，每隔3 d隨機(jī)抽取db/db小鼠及正常對(duì)照小鼠各6只,內(nèi)眥靜脈取血,EDTA抗凝，葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血漿胰島素及血漿IGF-1水平。當(dāng)抽檢的db/db小鼠表現(xiàn)出明顯的高血糖及高胰島素血癥后，測(cè)定全部小鼠的血糖、血漿胰島素及IGF-1水平，篩選出血糖升高顯著、胰島素抵抗明顯的db/db小鼠18只用于此后的應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 應(yīng)激性高血糖的誘發(fā) 選取入選實(shí)驗(yàn)的db/db小鼠及正常小鼠各6只，放入22 cm×20 cm×20 cm的籠內(nèi)，籠底由細(xì)銅柵構(gòu)成，通過(guò)銅柵給予小鼠足底電脈沖刺激。脈沖頻率及強(qiáng)度由電腦控制，每2~10 s間隨機(jī)發(fā)生1次，電壓50 V，每次持續(xù)50 ms，共刺激5 min。刺激前及刺激后每30 min尾靜脈放血，以美國(guó)Therasense公司微型血糖儀及血糖試紙測(cè)定血糖1次，觀察應(yīng)激性高血糖的發(fā)生及持續(xù)時(shí)間。同時(shí)測(cè)定未經(jīng)電脈沖刺激的db/db小鼠（n=6）及正常小鼠（n=6）的血糖作為對(duì)照。4組小鼠分別命名為正常對(duì)照小鼠（NC），電刺激的正常小鼠（NS），db/db對(duì)照小鼠（DC），電刺激的db/db小鼠（DS）。

1.2.3 應(yīng)激性高血糖的干預(yù) （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將上述18只入選實(shí)驗(yàn)的db/db小鼠測(cè)量血糖后，隨機(jī)分為3組。A組（db/db對(duì)照組，n=6），頸背部皮下注射等體積溶媒（鹽酸酸化生理鹽水，pH 5.2）；B組（胰島素治療組，n=6），頸背部皮下注射胰島素0.45 IU/kg；C組（rhIGF-1治療組，n=6），頸背部皮下注射rhIGF-1 600 μg/kg。D組（正常對(duì)照組，n=6），同品系的正常小鼠，頸背部皮下注射等體積溶媒。（2）干預(yù)方式：尾靜脈取血測(cè)定每只小鼠應(yīng)激前血糖，隨即進(jìn)行電脈沖刺激，刺激結(jié)束后立即進(jìn)行上述不同方式的干預(yù)，此后每30 min測(cè)定血糖1次，共測(cè)定3 h。

1.2.4 Real time-PCR檢測(cè)骨骼細(xì)胞中GLUT4基因表達(dá)水平 干 預(yù)結(jié)束后立即處死各組小鼠，剪取適量骨骼肌組織置于凍存管內(nèi)，-80℃低溫保存。取0.5g凍存的骨骼肌組織置于1 mL Trizol試劑中，提取組織總RNA。取1.0 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以管家基因β-actin為內(nèi)參照，采用SYBR green Real time-PCR試劑盒檢測(cè)GluT4基因cDNA。小鼠β-actin基因的擴(kuò)增引物為：上游5′-AGGGTGTGATGGT GGGAATG-3′，下游5′-CTCATTGTAGAAGGTGTGGTGC-3′；PCR產(chǎn)物大小為158 bp。小鼠GluT4基因的擴(kuò)增引物為：上游5′-CAGAGCTA CAATGCAACG-3′，下 游 5 ′-GCCAATGAGAAAGGAAGAG-3′ ；PCR產(chǎn)物大小為141 bp。PCR反應(yīng)在Roche LightCyler定量PCR儀上完成，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15 s，95℃5 s，55℃20 s，72 ℃ 1 0 s，45個(gè)循環(huán)。靶基因cDNA相對(duì)含量以2-ΔCt表示。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞膜中GLUT4 取0.5 g冷凍保存的骨骼肌組織置于1.5 mL RIPA裂解液中充分勻漿，1 000×g離心10 min。取上清液于40 000×g離心1 h，以0.5 mL含1%TritonX-100的PBS溶液懸浮沉淀，20%能量輸出條件下超聲破碎3次，每次30 s，間隔3 min。再次40 000 ×g離心1 h，上清液中含有細(xì)胞膜蛋白。BCA法測(cè)定膜蛋白樣本的總蛋白質(zhì)濃度，取50 μg膜蛋白行SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)膜，4%脫脂奶粉對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，以兔抗小鼠GLUT4多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗與膜進(jìn)行溫浴。將膜于發(fā)光底物溶液中浸泡4 min后對(duì)X線膠片進(jìn)行曝光，隨后對(duì)膠片進(jìn)行顯影及定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所 有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x ±s表示。重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 db/db小鼠相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 與同品系的正常小鼠相比，db/db小鼠在生后8周表現(xiàn)出肥胖、高血糖及明顯的IR癥狀，血IGF-1水平也明顯低于正常對(duì)照組，見圖1、表1。

表1 8周齡db/db小鼠及正常對(duì)照小鼠的部分指標(biāo)比較（n=6，±s）

表1 8周齡db/db小鼠及正常對(duì)照小鼠的部分指標(biāo)比較（n=6，±s）

**P<0.01

?

2.2 電脈沖刺激對(duì)血糖的影響 電脈沖刺激后，組間血糖水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=48.915，P<0.05），組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=1.295，P>0.05），組間和時(shí)間無(wú)交互效應(yīng)（F交互=1.046，P>0.05）。電刺激不同時(shí)間時(shí)，NC組和NS組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；DS組和NC、NS、DC組相比，在不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.001），見表2。

表2 電脈沖刺激對(duì)血糖水平的影響（n=6，mmol/L，±s）

表2 電脈沖刺激對(duì)血糖水平的影響（n=6，mmol/L，±s）

**P<0.01

組別NC組（1）NS組（2）DC組（3）DS組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）30 min 6.2±1.1 9.2±3.4 10.3±2.2 17.4±4.8 13.173**0.118 0.036<0.001 0.546<0.001<0.001 60 min 5.8±1.3 6.3±1.8 9.5±4.2 18.4±6.8 11.805**0.832 0.139<0.001 0.200<0.001<0.001 120 min 6.5±1.7 5.6±1.8 10.2±2.6 13.4±3.3 13.094**0.543 0.015<0.001<0.001<0.001 0.034 90 min 5.8±0.9 6.4±1.5 9.8±3.6 16.7±5.2 14.033**0.735 0.045<0.001 0.088<0.001<0.001

2.3 rhGF-1對(duì)應(yīng)激性血糖升高的保護(hù)作用 干預(yù)后，組間血糖水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=36.947，P<0.05），不同時(shí)間點(diǎn)血糖水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=13.880，P<0.05），且組間和時(shí)間存在交互效應(yīng)（F交互=11.769，P<0.05）。與 A組小鼠相比，rhIGF-1干預(yù)（C組）在干預(yù)60~90 min時(shí)即表現(xiàn)出了較明顯的降血糖作用，A、B組與D相比，在不同時(shí)間點(diǎn)的血糖水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表3。

2.4 骨骼肌中GluT4基因的表達(dá)水平 db/db小鼠肌肉組織中GluT4基因的表達(dá)水平低于同品系的正常小鼠。給予外源IGF-1可顯著增加GluT4基因的表達(dá)，而胰島素則不具有此作用，見表4。

2.5 細(xì)胞膜中GLUT4的含量 所提取的膜蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)，在與GLUT4蛋白分子質(zhì)量相符的位置上出現(xiàn)單一的曝光斑。與正常對(duì)照小鼠（D組）相比，db/db對(duì)照（A組）及胰島素干預(yù)組（B組）細(xì)胞膜內(nèi)GLUT4的含量明顯降低，IGF-1干預(yù)（C組）則可使GLUT4的含量顯著增加，見圖2。

表3 應(yīng)激前和干預(yù)后180 min血糖變化情況（n=6，mmol/L±s）

表3 應(yīng)激前和干預(yù)后180 min血糖變化情況（n=6，mmol/L±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別ABCDF P A∶B A∶C A∶D B∶C B∶D C∶D應(yīng)激前9.3±3.2 8.9±2.5 9.5±2.8 5.6±1.3 3.306*0.801 0.891 0.002 0.697 0.030 0.013 30 min 16.3±3.9 15.8±4.2 12.4±1.8 9.7±3.6 4.677*0.782 0.064<0.001 0.109<0.001 0.204 60 min 17.4±2.7 17.1±3.3 10.3±2.1 6.6±1.5 27.373**0.864<0.001<0.001<0.001<0.001 0.018 90 min 14.7±4.6 13.1±2.2 9.3±3.1 6.5±1.7 8.585**0.382<0.001<0.001 0.046<0.001 0.136 120 min 11.5±2.1 10.8±2.7 9.6±3.5 6.2±1.4 5.102**0.632 0.216<0.001 0.438<0.001 0.031 150 min 10.1±2.4 9.6±3.1 9.8±2.6 5.8±1.4 4.071*0.746 0.835<0.001 0.908 0.014 0.011 180 min 8.6±2.3 9.2±1.9 8.7±3.7 5.7±1.1 2.547

表4 骨骼肌中GLUT4基因的表達(dá)水平 （±s）

表4 骨骼肌中GLUT4基因的表達(dá)水平 （±s）

**P<0.01

ABCDF 0.007±0.001 0.009±0.001 0.041±0.008 0.109±0.015 185.548**組比A∶B A∶C A∶D B∶C B∶D C∶D P 0.695<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別 2-△Ct n 6666

3 討論

無(wú)論有無(wú)糖尿病，機(jī)體在面對(duì)刺激時(shí)均可能應(yīng)激性升高血糖[5]。但是糖尿病患者的應(yīng)激性高血糖難于控制且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，特別是伴有IR的T2DM患者所表現(xiàn)出的應(yīng)激性高血糖難以被大劑量的胰島素所控制，預(yù)后較差。研究顯示，IGF-1有明顯的降糖作用，特別是對(duì)有IR的糖尿病患者作用明顯[6]。本研究以瘦素受體基因缺陷的db/db小鼠為動(dòng)物模型，模擬伴IR的T2DM病例。db/db小鼠一般在生后6~10周表現(xiàn)出明顯的血糖升高及IR，本研究證實(shí)了db/db小鼠在生后8周發(fā)生了高胰島素血癥及高血糖。

采用胰島素和IGF-1干預(yù)顯示，對(duì)于胰島素治療無(wú)效的應(yīng)激性高血糖，IGF-1表現(xiàn)出了良好治療效果。為了探究IGF-1的降糖機(jī)制，本文研究了IGF-1對(duì)骨骼肌組織中GLUT4表達(dá)及轉(zhuǎn)位的影響。GLUT4所介導(dǎo)的葡萄糖攝取是外周組織利用葡萄糖的主要限速步驟[7]，GLUT4可通過(guò)表達(dá)的增加向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位這2種途徑來(lái)增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[8-9]。經(jīng)Real time-PCR及Western blot檢測(cè)證明，IGF-1不但可以顯著增加db/db小鼠骨骼肌組織中GluT4基因的表達(dá)，還可增加GLUT4在細(xì)胞膜的聚集，并可能因此增加糖的攝取而降低血糖。綜上，IGF-1可有效控制伴IR的T2DM產(chǎn)生的應(yīng)激性高血糖，其機(jī)制與調(diào)節(jié)GLUT4的表達(dá)及轉(zhuǎn)位有關(guān)。

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